CRT高表达对二烯丙基二硫诱导人白血病HL-60细胞分化的影响

来源 :南华大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:yangtianmei03
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目的:研究钙网蛋白(calreticulin,CRT)高表达对二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病HL-60细胞分化的影响以及与分化相关的分子机制。方法:运用RT-PCR、Western blot实验方法观察DADS作用HL-60细胞后CRT和其相关分子C/EBPα的变化情况。通过构建CRT高表达质粒,将CRT高表达质粒pcDNA3.1-12GS0643-IG-3转入HL-60细胞内,探讨CRT对DADS诱导HL-60细胞分化的影响。通过NBT还原实验、MTT比色法、Transwell实验进一步观察CRT高表达和DADS作用对HL-60细胞还原能力、增殖能力及迁移、侵袭能力的影响。结果:1.DADS对人白血病HL-60细胞CRT表达的影响Western blot、RT-PCR实验数据表明,以浓度为1.25mg·L-1DADS分别作用HL-60细胞12h、24h、48h后,同未用DADS处理组相对比,随着DADS处理时间的延长,CRT在蛋白水平和mRNA水平的表达呈逐渐下降的特点(P<0.05)。2. DADS对HL-60细胞C/EBPα表达的影响Western blot、RT-PCR实验数据表明,以浓度为1.25mg·L-1DADS分别作用HL-60细胞12h、24h、48h后,同不用DADS处理组相对比,随着DADS处理时间的延长,C/EBPα在mRNA水平和蛋白水平的表达呈逐渐升高的特性(P<0.05)。3. DADS对HL-60细胞迁移能力的影响迁移实验表明,用DADS分别作用人白血病HL-60细胞12、24h后,使其终浓度为1.25mg·L-1,同未用DADS处理组相比较,HL-60细胞的迁移能力随时间的延长而逐渐减弱(P<0.05)。4. CRT高表达对DADS作用HL-60细胞CRT表达的影响将质粒瞬时转染HL-60细胞,置于二氧化碳细胞培养箱中培养48h后,置于荧光显微镜下观察转染效果,可见细胞发绿色荧光,表明转染成功。RT-PCR实验结果显示,CRT高表达质粒转染的HL-60细胞CRT基因水平与转染阴性质粒组相比升高,且在DADS作用后,各实验组的CRT基因水平与未处理时相比均有所下降。Western blot显示,转染CRT高表达质粒的HL-60细胞其CRT蛋白表达水平与阴性转染组相比升高,用1.25mg·L-1DADS处理各实验组后,各组的CRT蛋白水平与未处理时相比均有所下降。RT-PCR与Western blot表明,1.25mg·L-1DADS处理阴性质粒转染组、未转染组和高表达组48h后,CRT的mRNA和蛋白表达水平跟未处理的阴性质粒转染组、未转染组和高表达组比较均明显降低(P<0.05)。表明高表达CRT mRNA和蛋白水平均高于阴性转染组和未转染组,且DADS能抑制CRT表达。5. CRT高表达对DADS作用HL-60细胞C/EBPα表达的影响将CRT高表达质粒和阴性质粒分别瞬时转染HL-60细胞,置于培养箱中培养48h后,于荧光显微镜下观察,能看到转染细胞发绿色荧光,说明转染成功。RT-PCR实验显示,CRT高表达质粒转染的HL-60细胞C/EBPα基因水平与转染阴性质粒组相比下降,且在DADS作用后,各实验组的C/EBPα基因水平与未处理时相比均有所升高。Western blot显示,转染CRT高表达质粒的HL-60细胞其C/EBPα蛋白表达水平与阴性转染组相比下降,用1.25mg·L-1DADS处理各实验组后,各组的CRT蛋白水平与未处理时相比均有所升高。RT-PCR与Western blot表明,1.25mg·L-1DADS处理阴性质粒转染组、未转染组和高表达组48h后,C/EBPα的mRNA和蛋白表达水平跟未处理的阴性质粒转染组、未转染组和高表达组比较均明显增高(P<0.05)。表明CRT高表达组C/EBPα miRNA和蛋白水平均低于阴性转染组和未转染组,且DADS能增加C/EBPα表达。6. CRT高表达对DADS作用HL-60细胞诱导其分化的影响NBT实验显示,在各时间段,CRT高表达组还原能力均弱于阴性转染组(P<0.05),分别用1.25mg L-1DADS和ATRA处理CRT高表达HL-60细胞,较未处理前相比,细胞的还原能力明显增强(P<0.05),其中1.25mg L-1DADS与ARTA比较其效果类似(P>0.05)。MTT实验显示,经DADS处理后,CRT高表达组、阴性转染组和未转染组细胞的增殖与处理前相比均受到抑制(P<0.05),表明DADS能抑制HL-60细胞的增殖。Transwell侵袭实验表明,同未处理的CRT高表达组、阴性转染组、未转染组相比,经DADS处理后的各组穿过基质胶的细胞数比处理前均明显减少(P<0.05);未转染组和阴性转染组无明显差异(P>0.05)。表明DADS能对HL-60细胞的侵袭能力产生抑制作用。结论:1.DADS可下调CRT诱导HL-60细胞分化,并可抑制HL-60细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2.DADS可上调C/EBPα在HL-60细胞内的表达,增加CD11b和降低CD33的表达。
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