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脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，能够强烈激活巨噬细胞，是引起内毒素性休克的主要原因。LPS释放进入血液后，迅速与脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)结合，并转运至CD14，然而糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl-inositol，GPI)连接的CD14缺少跨膜区，不能将信号转导进入细胞。 Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)和CD14是识别LPS的主要膜蛋白。CD14和TLR4的胞外区都包含多个包含富含亮氨酸的重复序列，TLR4的胞质区与LL-1(interleukin-1)的胞质区相似，因而被称为Toll／IL-1受体同源区(toll／IL-1 receptor homologous domain，TIR)。LPS激活TLR4能够引起核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活和细胞因子的释放。我们构建了CD14／TLR4mc的嵌合体，其N端是CD14，C端是TLR4的跨膜区和胞质区。在中国仓鼠卵巢K1细胞(Chinese hamster ovary-K1，CHO-K1)和人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293，HEK293)中，LPS能够通过CD14／TLR4mc激活NF-κB。CD14／TLR4mc在LPS激活NF-κB中的作用比TLR4强，超出了我们的预期，可能的解释是CD14与LPS具有较高的亲和力，LPS首先与CD14结合，形成LPS-LBP-CD14配体与辅助因子复合物后，再与TLR4结合将信号传递进入细胞。 我们进一步分析了CD14／TLR4mc在LPS诱导MAPK激活中的作用。在转染CD14／TLR4mc的HEK293细胞中，LPS能够激活p38和细胞外信号调节激酶(extracellar-signal regulated kinase，ERK)，而在CHO-K1细胞中，LPS只能激活p38，却不能激活ERK。这种差异可能源于不同的细胞系具有不同的信号转导特性，我们也不能排除人源的CD14／TLR4mc在HEK293细胞和CHO-K1细胞中具有不同的特性。 由于我们所使用的细胞系都不是TLR4缺损的细胞，我们用细菌同源重组法制备了截断形式TLR4(trancated form of TLR4，ΔTLR4)的腺病毒，利用ΔTLR4的功能缺损竞争排除TLR4在这些细胞中的作用。结果表明，ΔTLR4重组腺病毒显著抑制了TLR4的作用，而在感染ΔTLR4重组腺病毒的细胞，显示CD14/TLR4mc仍然能够介导LPS诱导的NF一沼激活。 对TLR4的启动子序列进行分析，我们发现TLR4启动子区的近端包含pU.l、激活子蛋白一l(activator protein一l，AP一l)和NF一沼的结合位点。先前的研究表明，p38的激活能够引起Pu.1和AP一1转录活性的增加，而LPs能够激活p38和NF一沼，我们推测LPS能够增加TLR4启动子的转移激活，我们用报告基因技术证实LPS能够通过CD14/T LR4mc激活TLR4启动子转录活性。 大多数膜蛋白经过翻译后修饰都会产生N-联一糖基化结构。MD一2是一个分泌蛋白，结合到TLR4的胞外区，形成细胞膜受体复合物，使TLR4对LPS产生反应。MD一2有两个N-联一糖基化位点，而TLR4有九个。共转染野生型的TLR4、MD一2和CD14具有强烈NF一妞的激活作用，TLR4和MD一2的去糖基化则显著抑制了LPS诱导的NF一沼激活。最近有报道说，NF一妞的激活可能参与了炎症的消退过程，我们推测TLR4和MD一2的正常结构和功能对于LPS诱导的炎症的消退可能是必需的。我们同时发现，TLR4启动子的转录激活与NF一虑激活的趋势相似，而p38在TLR4转移激活中可能发挥着重要作用。 我们随后建立了TAT融合蛋白转导进入细胞的方法，发现TAT一EGFP(e nhanced geen fluoreseence protein，增强型绿色荧光蛋白)的融合蛋白能够以较高效率进入细胞。我们纯化T TAT一MApK(mitogen一activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)融合蛋白并转导细胞，初步评价了它们对下游转录因子的激活作用。活化转录因子2(activating transeriPtion factorZ，ATFZ)是p38的公认底物，利用报告基因技术，我们发现野生型p38转导进入细胞后能够激活ATFZ，P38的AF突变体抑制了LPS对ATFZ的激活，ERK野生型和突变体的TAT融合蛋白对ATFZ的活性没有显著影响。 综上所述，我们研究了嵌合体CD14厅LR4m。在LPS识别和信号转导中的功能，初步发现CD 14汀LR4mc能够独立地识别LPS并将信号转导进入细胞;MD一2和TLR4糖基化位点的突变，抑制了LPS诱导的NF一沼激活和TLR4启动子活性;我们证实p38在LPS诱导的TLR4启动子转录激活中发挥重要作用，并推测MAPK和NF一虑不但参与了LPS诱导的炎症形成过程，可能也参与了炎症的消退过程。上述结果主要是在常用的工具细胞CHO一Kl和HEK293上获取的，鉴于单核细胞是LPS的主要靶细胞，上述结果仍然需要在单核细胞上的工作予以证实。