【摘 要】
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环二腺苷酸（cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP）是一种重要的第二信使分子,与特定受体蛋白或核糖开关结合,广泛调控细菌生长、钾稳态、渗透压平衡、细菌毒力、生物膜形成和DNA修复等生理功能。本实验室前期从自然发酵乳中筛选出高产胞外多糖的嗜热链球菌S-3,对其全基因组测序发现,嗜热链球菌含有c-di-AMP合成酶的保守Dis A＿N结构域。本文以预测的c-
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环二腺苷酸（cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP）是一种重要的第二信使分子,与特定受体蛋白或核糖开关结合,广泛调控细菌生长、钾稳态、渗透压平衡、细菌毒力、生物膜形成和DNA修复等生理功能。本实验室前期从自然发酵乳中筛选出高产胞外多糖的嗜热链球菌S-3,对其全基因组测序发现,嗜热链球菌含有c-di-AMP合成酶的保守Dis A＿N结构域。本文以预测的c-di-AMP合成酶基因为研究对象,对其编码蛋白StDAC（Stheptococcus thermphilus DAC）功能解析,为阐明嗜热链球菌c-di-AMP信号调控奠定基础。具体研究内容如下:（1）通过生物信息学分析,在嗜热链球菌S-3基因组中仅发现1个c-di-AMP合成酶基因orf0696,对其编码蛋白StDAC通过NPSA、SWISS-MODEL和Modeller等软件进行二级结构预测和三维结构模拟。建立的StDAC三维模型通过Flexible docking与底物ATP或ADP分子对接,结果表明StDAC能与ATP（-362.68 kcal/mol结合能）或ADP（-468.47 kcal/mol结合能）结合催化合成c-di-AMP,且StDAC更倾向于以ADP为底物。（2）通过超高效液相色谱-四级杆轨道阱质谱（UPLC-QEMS）分析嗜热链球菌S-3裂解液,确定嗜热链球菌胞内含有c-di-AMP。大肠杆菌异源表达StDACX后在细胞裂解液中检测到c-di-AMP的存在,表明StDAC即为c-di-AMP合成酶编码基因。构建c-di-AMP高亲和力结合受体ydaO核糖开关与红色荧光蛋白（RFP）结合的重组载体ydaO-RBS-RFP,使细胞内c-di-AMP浓度与红色荧光蛋白荧光强度相关联,实现c-di-AMP的体内快速检测,过表达基因orf0696菌株荧光强度比对照提高18%（P＜0.05）。上述结果均表明orf0696为嗜热链球菌c-di-AMP合成酶基因。（3）对c-di-AMP合成酶基因orf0696及其相邻基因共转录情况分析表明,orf0696与基因ybb R、glm M、gtr A、trm K、nif3和zup T位于同一操纵子。菌株生长结果发现,过表达StDAC显著降低嗜热链球菌的比生长速率（P＜0.05）,但缩短了迟滞时间。对不同金属离子(Na+、K+和Zn2+)敏感性测定发现,过表达StDAC在低Na+（＜200 m M）浓度培养基中对嗜热链球比生长速率、迟滞期和倍增时间无显著影响,但高Na+浓度培养基中比生长速率和倍增时间显著增加（P＜0.05）。而过表达StDAC在高K+（＞200 m M）或Zn2+（＞5μM）培养基中对嗜热链球菌生长无显著影响,但在低K+培养基中迟滞时间缩短和倍增时间延长,在低Zn2+（3μM）培养基中显著提高比生长速率（P＜0.05）。过表达StDAC使嗜热链球菌胞外多糖产量下降22.0%（P＜0.05）,且显著抑制胞外多糖合成基因簇中eps A-eps M 13个基因的表达,表明c-di-AMP可能调控胞外多糖的生物合成。
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