苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）即Bt,在其产孢过程中可以形成Cry类专一高效的杀虫晶体毒素,且对生物有机体无害,以Bt叶片喷雾剂及转基因作物等方式被广泛应用于农业害虫的防治。然而,Bt毒素的大规模商业化应用造成的田间抗性快速进化阻碍了其可持续性利用。同时,由于对昆虫Bt抗性复杂机制理解的匮乏,严重妨碍了Bt害虫的抗性治理和新型Bt杀虫晶体蛋白的开发及应用。因此,为保证Bt生物杀虫剂的安全性和经济效益,有必要阐明昆虫对Bt毒素的抗性分子机制。小菜蛾（Plutella xylostella（L.））是一种全球性分布的主要为害十字花科作物的重要害虫,易对各种杀虫剂快速形成抗性,每年可在世界范围内造成40多亿美元的重大经济损失。而作为第一个被报道在田间对Bt喷洒药剂产生抗性的害虫,小菜蛾已经成为探究复杂Bt抗性分子机制和理论基础的模式昆虫。在不同昆虫不同抗性品系中的Bt抗性机制是非常复杂的,近年来有多种害虫被报道其中肠蛋白酶与Bt抗性相关或无关。同时,在已经建立的经典模型和新提出的Bt Cry毒素双重模型中,中肠蛋白酶对原毒素的激活都是必不可少的关键步骤,且毒素不正确的激活过程有可能使昆虫对Bt Cry毒素产生抗性。那么,这些因素与本实验室小菜蛾抗性品系的关系是什么呢?本文在前期研究的基础上,选取Bt Cry1Ac敏感（DBM1Ac-S）和高低抗性不同的小菜蛾品系为实验材料,通过使用各种基因组学、分子生物学、生物化学、遗传学和生物信息学等实验技术方法和平台开展试验及验证分析,揭示中肠胰蛋白酶（trypsin）和胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的关系。研究结果显示,在小菜蛾田间进化的近等基因系（Near-isogenic line）NIL-R高抗品系中,中肠蛋白酶介导的原毒素激活与Bt Cry1Ac抗性没有直接联系,且支持经典的毒素作用模式。而在实验室汰选的小菜蛾SZ-R抗性品系中,参与毒素激活的新型中肠胰蛋白酶基因PxTryp＿SPc1的表达量下调与Bt Cry1Ac抗性相关。主要内容和研究结果如下:1、小菜蛾的大量继代养及室内抗性汰选在实验室专门的养虫室内,配置良好的昆虫饲养环境以及本实验室前期摸索的甘蓝萝卜苗法进行小菜蛾室内大规模人工隔离饲养。同时,沿用本实验室一直以来标准化的小菜蛾幼虫Bt毒素抗性汰选方法来进行筛选以维持和保证抗性品系的抗性倍数和稳定性,为后续功能性试验的开展提供了充足和良好的试验材料。2、小菜蛾trypsin或chymotrypsin介导的毒素激活及其对Bt Cry1Ac毒素抗性的关系在本文中,我们评估了敏感DBM1Ac-S品系及其田间进化对Bt Cry1Ac产生高水平抗性的小菜蛾近等基因系NIL-R品系的Cry1Ac毒素激活情况。生物测定的实验结果表明,抗性NIL-R品系幼虫对Bt Cry1Ac原毒素和胰蛋白酶激活的活化毒素均产生了高水平的抗性,但对于Bt Cry1Ac原毒素的抗性倍数与激活毒素的抗性倍数之间的差异并不显著。随后,酶活性检测的结果显示在敏感品系DBM1Ac-S和抗性品系NIL-R之间酪蛋白水解蛋白酶（即总蛋白酶）、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶之间的酶活性均无显著性差异。此外,当用Bt Cry1Ac原毒素或激活毒素分别加入胰蛋白酶抑制剂Nα-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮（Nα-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone,简称TLCK）或胰凝乳蛋白酶抑制剂N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮（N-p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone,简称TPCK）处理后再次进行毒力生物测定比较,结果表明在加入相应的蛋白酶抑制剂后敏感和抗性品系的幼虫对Cry1Ac毒素的敏感性也无显著性影响。而且,敏抗品系之间的原毒素激活与孵育毒素时间的长短或中肠液浓度的高低影响不大。这些实验结果证明小菜蛾田间进化的NIL-R抗性品系对Bt Cry1Ac的抗性与中肠蛋白酶介导的改变原毒素激活无关。3、小菜蛾trypsin和chymotrypsin家族基因的注释利用生物信息学的方法和技术对小菜蛾基因组数据进行分析,经过鉴定及克隆后,成功得到21个trypsin基因和8个chymotrypsin基因,这些基因均为鳞翅目小菜蛾中肠蛋白酶中的基本基因构成。后使用转录组数据对这些中肠蛋白酶基因进行相关表达量的分析,从整体水平上筛选差异基因。继而通过与其它不同目昆虫中trypsin和chymotrypsin蛋白进化关系的分析确定这些基因在不同物种间的进化是相对保守的。4、小菜蛾中肠胰蛋白酶基因PxTryp＿SPc1与Bt Cry1Ac抗性关系的研究通过分析本实验室汰选的小菜蛾Bt Cry1Ac抗性品系SZ-R的转录组数据,发现了一个新的胰蛋白酶基因PxTryp＿SPc1,且其呈现下调状态。（1）酶活性测定与毒素激活试验表明,该小菜蛾SZ-R抗性品系中PxTryp＿SPc1基因表达量的减少可显著降低酪蛋白水解酶和胰蛋白酶的酶活性,进而影响Cry1Ac原毒素的活化。（2）毒力测定结果显示,在SZ-R品系中,小菜蛾幼虫对Cry1Ac原毒素的抗性高于激活毒素的,Cry1Ac活化毒素比Cry1Ac原毒素更有效。（3）为继续开展后续的功能验证,成功克隆了PxTryp＿SPc1基因的全长cDNA序列,并使用qPCR技术检验其表达情况,结果发现该基因主要在所有幼虫龄期的中肠组织中表达,且在幼虫第四龄期达到最高的表达水平峰值,说明其潜在的重要性。（4）同样运用q PCR技术证实了PxTryp＿SPc1基因在小菜蛾SZ-R抗性品系的幼虫中肠中的表达水平明显降低,并在选择更高剂量Cry1Ac原毒素处理检测存活下来幼虫的该基因表达水平时进一步降低。（5）通过遗传连锁实验分析表明PxTryp＿SPc1基因的下调与SZ-R抗性品系对Cry1Ac的抗性遗传相关。（6）在小菜蛾敏感DBM1Ac-S品系中使用RNAi技术敲除该基因,结果表明沉默PxTryp＿SPc1基因后降低了敏感DBM1Ac-S品系对Cry1Ac毒素的敏感性。这些结论支持PxTryp＿SPc1基因的低表达与小菜蛾SZ-R品系对Bt Cry1Ac的抗性有关。总之,以上发现提出了对Bt抗性机制的新见解,有助于更好地理解中肠蛋白酶在昆虫对Bt毒素的抗性机制中发挥的作用,对Bt作物或Bt制剂抗性的检测与综合治理,对新型Bt作物或新型毒素蛋白的研发及可持续应用均有重要的指导意义。