研究背景与目的热休克蛋白70(Hsp70/HSPA1A)是细胞在应激条件(如高温,缺氧,缺血,病毒感染,组织损伤等)下诱导表达的一种分子伴侣蛋白质,在蛋白装配、折叠、运输、促进受损多肽重折叠和降解等多种细胞生理过程中均发挥着重要作用。Hsp70主要由近N端的ATP结合域(ATPase结构域)和近C端的底物结合域组成。研究表明,细胞内Hsp70表达升高与多种肿瘤的发生发展相关,并且其升高程度与恶性肿瘤分级,转移及化疗耐药性产生关系密切。在乳腺癌,子宫内膜癌,大肠癌,前列腺癌及某些类型白血病中,肿瘤细胞高表达Hsp70与不良预后密切相关;动物实验证明敲除Hsp70基因可抑制裸鼠移植瘤模型中癌细胞的成瘤过程。Hsp70在肿瘤发生发展中的重要地位使之成为非常有前景的抗肿瘤治疗药物靶点,HsP70抑制剂有望发展成为新一类临床靶向治疗药物。目前已经有研究尝试开发各种Hsp70抑制剂,包括作用于ATP结合域的ATP模拟物,二羟嘧啶类化合物等,以及作用于底物结合域的寡核苷酸适配子,苯基乙炔磺酰胺等等。由于Hsp70在细胞的许多正常生理活动也不可或缺,作为治疗药物的Hsp70抑制剂需要具有很高的特异性,有效性和安全性。本实验室前期研究发现在肿瘤细胞中,Hsp70常常不是作为一个独立的个体发挥作用,而是与其协同蛋白(如Bag3蛋白)结合形成复合体后再作用于其它分子。Hsp70-Bag3复合体在肿瘤相关的多种细胞通路中发挥调控作用,如上调与肿瘤细胞存活和转移有关的FoxM1通路和HuR通路等。Bag3作为支架蛋白介导了 HsP70对许多肿瘤相关信号通路分子的调控作用,特异性的干预Hsp70-Bag3复合体的形成可以在抑制Hsp70促进肿瘤形成和发展作用的同时,尽量减少对其发挥正常生理功能的影响。近年来,本课题组与Jason Gestwicki教授及其团队合作研发出了一系列变构体抑制剂,抑制剂与Hsp70结合后可引起Hsp70构象改变,进而干预Hsp70与Bag3的结合。以YM-01为代表的第一代抑制剂在肿瘤细胞信号通路调控及抑制肿瘤生长方面达到了与敲除Hsp70基因相似的作用效果,但是该类药物的半衰期较短,不适合临床应用。在YM-01基础上进一步改进得到的第二代抑制剂JG-98,在延长药物半衰期的同时,JG-98与Hsp70亲和力更强。本课题组前期研究证实JG-98可通过与Hsp70分子的ATPase结构域结合,引起Hsp70分子构象发生改变,使Hsp70停滞于ADP结合状态,阻断Hsp70与其伴侣蛋白Bag3或其它Bag家族的蛋白形成复合体的过程,并在细胞及动物实验中表现出了显著的抗肿瘤作用。虽然JG-98的抗肿瘤效果明显,但仍有许多问题有待探索:JG-98在肿瘤细胞中调控的细胞通路仍未完全明确;JG-98除了干扰Hsp70-Bag3复合体以外,是否还通过其他方式调控相关信号通路等。另一方面,最近研究发现抑制热休克蛋白家族的另一成员HsP90达到的抗癌效果与抑制Hsp70相似,目前已有大量Hsp90抑制剂研发产生,其中替拉替尼(tanespimycin/17AAG)已进入Ⅱ期临床试验阶段。有研究报道表明同时敲除Hsp70家族中的两个主要成员基因(诱导型Hsp70和结构型Hsc73)引起的细胞生理变化与Hsp90抑制剂作用于细胞产生的效果相似。提示作为Hsp70抑制剂的JG-98的抗肿瘤作用可能与Hsp90抑制剂类似,若两者抗癌机制相似,这将极大地降低JG-98的研究价值。Broad Institute Platform(博得研究所)是隶属于麻省理工学院和哈佛大学及其附属医院的基因组学研究中心,Connectivity Map(Cmap)是该研究所基于RNA芯片技术研究药物作用机制的工具和数据资源平台,该平台整合了目前已通过美国Food and Drug Administration(FDA)认证的所有药物作用于多种人类肿瘤细胞后引起的基因表达图谱变化信息,可用于全面分析药物对肿瘤细胞全基因组水平基因表达情况的影响,并可与已知药物或疾病进程相关基因表达图谱比较,预测分析新研发药物或未知试剂的作用机制。本研究通过Connectivity Map数据库比较应用Hsp70抑制剂(JG-98)或Hsp90抑制剂(17AAG)处理不同肿瘤细胞系后,细胞基因表达图谱的变化情况,分析JG-98作为新型抗癌药物的研究价值;利用多种实验技术探究乳腺癌细胞中JG-98所调控的信号通路,及其发挥调控作用的分子机制。应用慢病毒shRNA文库筛选影响乳腺癌细胞对JG-98敏感性的相关基因,对基因进行信号通路归纳分析或结合Cmap分析结果,预测能够增加乳腺癌细胞对JG-98敏感性的相应增效剂,并通过细胞实验和动物实验进行验证;为选择能增强JG-98抗癌效能的配伍用药提供参考,为药物联合应用治疗方案的制定提供新的思路和方法。材料与方法1.比较Hsp70抑制剂JG-98与Hsp90抑制剂17AAG对肿瘤细胞基因表达图谱影响的异同。选取5种不同种类人类肿瘤细胞系,分别给予5种不同浓度JG-98或17AAG处理后,提取细胞RNA,对所得样本进行RNA芯片检测。通过Connectivity Map分析比较上述两类药物所引起的肿瘤细胞基因表达图谱变化的异同,筛选对肿瘤细胞基因表达图谱具有相似影响的药物,并将两种药物的分析结果进行比对。2.提取JG-98处理后的乳腺癌细胞RNA并进行Microarray分析,应用基因集富集分析(gene set enrichment analysis GSEA)技术及蛋白质磷酸化水平分析技术(可分析与细胞内20多个主要信号通路相关的50多个重要分子的磷酸化状态和磷酸化水平)筛选JG-98在乳腺癌细胞中所调控的信号通路。3.在前期信号通路分析实验所得结果基础上,选取MAPK通路,AKT通路与c-myc通路进行进一步研究,通过shRNA敲除乳腺癌细胞Bag3基因,JG-98处理细胞后,对以上信号通路相关蛋白水平进行检测,探究JG-98对上述信号通路的调控是否与Hsp70-Bag3复合体有关,尝试阐明JG-98调控各信号通路的具体机制。4.运用慢病毒shRNA文库感染乳腺癌细胞后通过抗生素筛选慢病毒感染成功的细胞,并将细胞随机分为对照组与实验组,对照组不行药物处理,实验组给予JG-98药物处理直到仅剩少量细胞(25%)存活,提取两组细胞DNA后进行PCR扩增及测序,比较对照组与JG-98处理组中相应shRNA所占比例的变化,筛选与乳腺癌细胞JG-98敏感性相关的基因。5.分析shRNA文库筛选所得基因,预测与乳腺癌细胞JG-98敏感性相关的信号通路,筛选调控相关通路的药物,通过乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,BT474)体外细胞学实验,及裸鼠移植瘤模型实验,探究所选药物对JG-98的增效作用。将shRNA文库筛选所得基因输入Cmap数据库,筛选可以增强乳腺癌细胞对JG-98敏感性的相关药物,并利用乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)进行体外细胞学实验验证。结果1.在Connectivity Map给出的14项与Hsp90抑制剂17-AAG作用机制最为相似的药物记录中,所有药物均为HsP90抑制剂,药物间相似度得分均高于0.89;经过分析Hsp70抑制剂JG-98处理组细胞的RNA芯片结果,在系统给出的所有14项与其作用机制最为相似的药物记录中,并未发现HsP90抑制剂,且所有药物相似度得分均低于0.65。2.GSEA系统分析结果显示JG-98下调乳腺癌细胞内176条信号通路,上调19条信号通路。对所得通路中的主要基因进行分析整合,得到以下JG-98主要下调的基因集:(1)细胞周期家族,(2)RNA处理及切割,(3)蛋白酶体,热休克蛋白及伴侣蛋白(CCT伴侣),(4)细胞能量相关基因,包括呼吸链,ATP合成,Crebs循环及糖酵解,(5)细胞内甾体合成。JG-98主要上调的基因集包括:(1)未折叠蛋白反应基因(UPR unfolded protein response),(2)昼夜周期相关基因,(3)p53/DNA损伤反应基因。3.蛋白质磷酸化水平分析结果与GSEA结果基本吻合,经JG-98处理后,乳腺癌细胞(MCF7)中的细胞周期相关基因受到抑制(P21和P27上调),DNA损伤反应基因激活(H2AX及Chk2蛋白磷酸化水平升高),UPR通路激活(calnexin和PDI升高)。除此之外,蛋白质磷酸化水平分析也揭示了 JG-98在乳腺癌细胞中调控的其它通路,包括(1)下调NF-kB、FAK-Src、Notch和WNT通路;(2)激活mTOR和MAPK通路。4.Western Blot证实,经JG-98处理后,乳腺癌细胞(MCF7)中ERK1/2的磷酸化水平明显升高,且磷酸化升高水平随药物浓度增高而升高;应用shRNA敲除MCF7细胞Bag3基因后,ERK1/2的磷酸化水平明显升高。Inter-Q实验证实Bag3与ERK1/2在细胞中相互结合并形成复合体,且JG-98可干扰复合体的形成。qPCR结果显示2μM JG-98处理MCF7细胞4h后,细胞内Bag3与ERK1/2的结合量降低了 38.88%。对pho-ERK1/2去磷酸化速率的监测实验显示,经JG-98处理后,乳腺癌细胞中pho-EKR1/2去磷酸化速率明显降低。5.Western blot证实,经JG-98处理,乳腺癌细胞(MCF7)中pho-AKT水平及c-myc水平明显降低;而shRNA敲除Bag3基因对pho-AKT水平及c-myc水平没有明显影响;且使用JG-98处理敲除Bag3后的MCF7细胞,药物对pho-AKT及c-myc的下调作用反而增强。shRNA敲除Bag1基因或Bag6基因对pho-AKT水平及c-myc水平亦无明显影响。6.对shRNA文库基因测序筛选结果进行信号通路分析后发现:抑制蛋白酶体相关基因可增加乳腺癌细胞对JG-98的敏感性;下调RNA聚合酶Ⅱ(RNApol Ⅱ)合成相关基因可增加敏感性;其他相关通路包括高尔基体转运相关通路,敲低ARF1或ARFGAP1可降低敏感性,相反如果敲低ARFGEF2基因,则可增加敏感性;TGF-β通路,敲低该通路的正向调解因子TGFBP1,FNTA,SMAD2,AXIN和Usp9X可降低敏感性,而敲低该通路的负向调节因子STRAP可增加敏感性;同样的还有WNT通路,敲低FXD3,FZD4,FZD7,FZD8,FGF8和TCF7L1增加敏感性,敲低AXIN降低敏感性。7.细胞学MTT实验证实联合应用蛋白酶体抑制剂(MG132)与JG-98处理乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和BT474),对乳腺癌细胞生长的抑制和杀伤作用明显强于单独用药。在MDA-MB-231细胞裸鼠皮下成瘤模型中,联合应用蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortzomib与JG-98,对裸鼠皮下瘤体生长的抑制作用明显强于单独用药。8.体外细胞学MTT实验证实联合应用RNApol Ⅱ基因抑制剂α-amanitin可明显增强JG-98对乳腺癌细胞(HCC1937,BT549)的抑制和杀伤作用。9.应用Connectivity Map分析shRNA文库筛选结果,提示AKT通路抑制剂(LY294002)与酪氨酸激酶受体抑制剂(sunitinib)可增加乳腺癌细胞对JG-98的敏感性。体外细胞学MTT实验证实联合应用以上两种药物均可增加JG-98对乳腺癌细胞的抑制和杀伤作用。结论1.Hsp70抑制剂(JG-98)与Hsp90抑制剂(17AAG)引起的肿瘤细胞内基因表达图谱的变化并不相同。JG-98的抗肿瘤机制有独特性和创新性,具有较高的研究价值和较好的临床应用前景。2.通过GSEA及蛋白质磷酸化水平分析探究JG-98在乳腺癌细胞中所调控的部分细胞通路,为进一步了解JG-98发挥作用的具体机制提供理论依据。3.JG-98通过抑制Hsp70-Bag3复合体的形成,干扰Bag3与ERK1/2结合,影响MKP3磷酸激酶对ERK1/2的去磷酸化,减缓ERK1/2的去磷酸化速率,引起ERK1/2的活化水平升高。4.JG-98下调AKT通路和c-myc通路,使乳腺癌细胞内pho-AKT水平和c-myc水平降低,且对以上通路的下调作用与Bag1,Bag3及Bag6无关。5.蛋白酶体抑制剂(MG132/硼替佐米bortzomib),RNApol Ⅱ基因抑制剂(α-amanitin),AKT通路抑制剂(LY294002),酪氨酸激酶受体抑制剂(sunitinib)都可增加乳腺癌细胞对JG-98的敏感性,可作为选择JG-98增效剂及配伍用药的理论依据。6.shRNA文库筛选结合信号通路分析或联合Connectivity Map都可作为预测抗肿瘤药物增效剂的有效手段。意义1.应用基因表达图谱分析方法(Connectivity Map)鉴定了 Hsp70抑制剂JG-98与Hsp90抑制剂17AAG之间抗肿瘤机制的不同;2.首次揭示了 JG-98在乳腺癌细胞中所调控的信号通路,并验证了 Hsp70-Bag3复合体在部分通路调节中的地位,即JG-98既通过Bag3依赖方式也通过Bag3非依赖方式进行信号通路调控;阐明乳腺癌细胞中JG-98上调MAPK通路的作用机制;3.首次提出通过shRNALibrary筛选得到药物敏感性相关基因,进行基因信号通路分析或结合Connectivity Map的方法预测药物增效剂,为临床选择抗肿瘤联合用药提供了新思路新方法。