慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是指各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍,包括肾小球滤过率正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常,及影像学检查异常,或不明原因滤过率下降超过3个月。所有的慢性肾脏病最终均可发展为肾脏纤维化。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis)是一种病理生理改变,是肾脏的功能由健康到损伤直至丧失的渐进过程,而肾间质纤维化是引起终末期肾功能衰竭的主要原因。目前来看,临床上缺乏治疗或延缓肾脏纤维化的有效手段,因此寻找有效的方法来阻断或者延缓肾脏纤维化对于慢性肾脏病的治疗具有重大意义。肾小管上皮细胞在人体内是代谢水平较高的细胞之一,对能量的需求亦较大。研究发现病情处于第4、5期的CKD患者肾脏中ROS的生成明显增多,线粒体损伤相关指标明显上调,这表明线粒体功能障碍与CKD的进展有着密切的关系。本课题组前期研究发现,线粒体功能障碍会加重肾小管上皮细胞转分化。Lon protease1(LONP1)是一种在各种生物中都高度保守的蛋白酶,是与多种细胞活性相关的ATP酶。LONP1作为一种多功能蛋白酶,参与了体内的多种生物代谢的活动,其具有分子伴侣的功能,可以降解错误折叠的蛋白质,参与体内的氧化应激过程,去除氧化和受损的蛋白,同时参与生物衰老的过程。研究表明LONP1对线粒体的结构和功能的稳定有重要作用。LONP1不仅对蛋白质与量有着重要调控作用,还参与线粒体功能的调节,当慢性肾脏病致肾脏纤维化时,LONP1表达是否有变化,这一变化是否与疾病的发生及进展有联系尚未清楚。因此,深入研究LONP1在慢性肾脏病中表达的时空规律,或可为阻断或延缓肾脏间质纤维化这一病理过程提供新思路。目的:通过体外、体内,及临床三部分的实验,来观察LONP1在慢性肾脏病中表达的规律,探讨两者之间的联系。方法:1>培养人永生肾小管上皮细胞系HK-2细胞,传代并铺板,通过Ang-Ⅱ处理(作用浓度为10nM,作用时间点为12、24小时),诱导细胞损伤,并以相对应的溶剂(DMSO)处理组作为对照。Real-time PCR、western-blot检测LONP1的表达变化,以及此时纤维化指标collagen Ⅰ、α-SMA,炎症因子IL-1β表达变化。2>129野生型小鼠构建UUO模型,分别于1、3、7、10、14天处死小鼠,收取肾脏组织标本,对照组选取同周龄小鼠行假手术,应用Masson染色来评价肾脏纤维化的程度,HE染色观察炎性细胞浸润;Real-time PCR、western-blot检测LONP1在mRNA和蛋白水平表达变化,以及肾脏纤维化相关指标(collagen Ⅰ、α-SMA、E-cadherin)和炎症指标(IL-1β、MCP-1)在mRNA和蛋白水平表达的变化;免疫组化检测LONP1在肾脏表达定位及表达变化。3>肾间质纤维化程度不同的CKD患儿的肾活检组织的石蜡标本30例,根据病理结果肾间质纤维化的程度,分为轻、中、重三组,每组10例(依据肾间质纤维化的范围及程度划分:病变范围<25%为轻度,25%～50%为中度,病变范围>50%为重度),免疫组化染色检测LONP1的表达及分布,结合Katafuchi半定量标准对肾脏病变进行评分,对LONP1表达变化与肾间质纤维化、炎症细胞浸润、肾小球慢性病变相关性进行分析。结果:(1)在Ang-Ⅱ诱导的肾小管细胞损伤模型中,与control组相比LONP1的mRNA水平表达量明显降低,12、24小时均降低50%左右,P<0.001;LONP1蛋白表达水平亦有显著减低(12小时减少了 45%,24小时减少了 40%,均P<0.01)。观察肾脏纤维化相关指标表达的变化,collagen Ⅰ的mRNA表达水平在给予Ang-Ⅱ刺激后明显的升高:与control组相比给药12、24小时后均明显上调,12小时增加了约30%,P<0.05;24小时后上调了约40%,P<0.001;在细胞给予刺激12小时后collagen Ⅰ的蛋白表达量是control组的3.1倍(310%,P<0.001);24小时组蛋白表达量是control组的4.2倍(420%,P<0.001)。α-SMA的mRNA表达也有所升高,12小时表达量约为control组的 1.5 倍(150%,P<0.05);24 小时表达量是 control 组的 1.75 倍(175%,P<0.001);α-SMA蛋白表达水平在刺激后12小时增加了约40%(P<0.05),24小时增加了约1.6倍(160%,P<0.001)。炎症因子IL-1β的mRNA表达水平也有明显的上调,12、24小时分别是control组的2倍(200%,P<0.05)和2.8倍(280%,P<0.01)。(2)在UUO模型小鼠中,Masson染色观察到与Sham组相比,UUO组的小鼠随造模时间的延长病理损伤进行性加重,造模1天小鼠仅有轻微肾小管扩张;造模3天时肾组织出现明显的肾小管扩张,少量的胶原纤维沉积;造模7天、10天出现部分肾小管萎缩,肾间质大量胶原蛋沉积;造模14天,肾组织结构明显破坏,小管萎缩,大量胶原蛋沉积。应用HE染色观察到炎症细胞浸润随造模时间延长而进行性加重。LONP1 mRNA水平的表达在UUO模型各时间点的表达无明显差异,进而用western-blot技术来检测LONP1蛋白水平表达的变化:与Sham组相比,LONP1蛋白在术后第一天表达水平无明显变化,术后3、7天有明显下调,均下降了约30%(P<0.05),术后10、14天下调更加明显,表达量与对照组相比减少了约61%左右(P<0.001)。应用免疫组化染色法对LONP1的表达进行定位,发现LONP1在正常肾组织小管细胞中有较高的表达量,同时观察到LONP1蛋白表达量在造模时间为1天时无明显变化,后随纤维化加重而减少。Real-time PCR检测肾间质纤维化指标结果显示,与Sham组相比,UUO造模组collagen Ⅰ、α-SMA mRNA水平的表达均有明显的上调,并随着UUO天数的增加,各指标mRNA水平表达量逐渐增多(至术后14天分别增加了约150倍,P<0.001;10倍,P<0.001)。collagen Ⅰ蛋白表达量在UUO术后第1天表达量无明显变化,3、7、10、14天时表达明显增高:3、7、10天组均增高了 1 倍(100%)左右,P<0.05;14 天组增高了约 2.5 倍(250%),P<0.001。α-SMA蛋白表达在术后第1天的表达亦无明显变化,术后3、7、10、14天表达有明显的升高,至术后14天时约增高了 2倍(200%,P<0.001)。E-cadherin的mRNA表达水平有明显的下降,蛋白表达量亦随造模时间的增加明显下调(术后14天时分别下调约75%和67%,P<0.001)。炎症指标IL-1β、MCP-1 mRNA水平表达量明显的升高(至术后14天时分别增加了 62倍,P<0.001;800倍,P<0.001)。(3)结合临床,观察LONP1在CKD患者肾脏组织中表达的位置和表达量变化:免疫组化染色结果发现LONP1在肾小管中高表达,与对照组相比,随着肾脏纤维程度的加重,LONP1蛋白水平表达量明显的下调:轻度肾脏纤维化组LONP1表达量无明显变化,中度纤维化组LONP1表达量较正常组下调了约30%左右(P<0.05),重度纤维化组下调更为明显,下降约50%(P<0.001)。结合病理评分发现随着肾小管萎缩及间质纤维化、炎性细胞浸润和肾小球慢性病变程度加重,LONP1表达量逐渐减少,即LONP1表达量与这三个肾脏病变指标之间存在负相关(r=0.817,P<0.001;r=0.753,P<0.001;r=0.645,P<0.001),这些数据都表明 LONP1 表达下调越明显,肾间质纤维化病变程度越重。结论:在体外实验和动物模型中,LONP1的表达均与肾间质纤维化存在时空关系:Ang-Ⅱ可呈时间依赖性的降低体外培养的肾小管上皮细胞中LONP1表达;UUO模型中随着纤维化程度的加重,LONP1表达逐渐下降,LONP1表达与肾脏纤维化呈负相关;在CKD患者肾组织小管细胞中LONP1表达量明显减少,且这种下调与肾小管萎缩及纤维化程度、炎症细胞的浸润、肾小球慢性变存在伴行关系,即病变程度越重,LONP1的表达量越少。