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第一部分铁蓄积对成骨细胞生物活性影响的研究目的 研究成骨细胞在铁蓄积状态下的生物活性指标,探讨铁蓄积对成骨细胞生物活性影响机制。方法 hFOB1.19常规培养,培养基中分别加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度的FAC,构成铁蓄积环境,检测成骨细胞生物活性指标:铁离子、细胞增殖活性、ALP活性、细胞凋亡、钙结节染色、I型胶原(COL1)和骨钙素(OC)的基因及蛋白表达;膜转铁蛋白1(FPN1)mRNA、转铁蛋白受体(TfR)mRNA和二价金属转运蛋白1(DMT1)mRNA 的表达;检测活性氧(ROS)、丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)的水平,同时进一步使用2.5mmol/L抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预,检测细胞内ROS的水平、细胞活力、细胞OPG、OC和COL1 mRNA的表达以及ALP活性。结果 随着FAC浓度的增加,细胞内铁离子的含量逐渐增加,成骨细胞的增殖、矿化、分化、COL1、OC的基因和蛋白表达随剂量变化减低;FPN1mRNA的表达及MDA、ROS水平随干预浓度FAC增加随剂量变化上调,TfR、DMT1mRNA的表达及SOD、GSH-PX活性随剂量变化下调(P<0.05);加入NAC后,所有干预组当中成骨细胞内活性氧含量有着显著的差异(P<0.05),其中FAC组活性氧含量要高于对照组,加入NAC组低于FAC组、高于NAC组;各组之间的成骨细胞的活力与活性氧含量的变化、COLlmRNA表达及OPG、OC以及ALP的活性表现出负相关(P<0.05)。结论铁蓄积对成骨细胞的生物活性表现为剂量依赖性抑制,其机制可能与细胞内铁蓄积导致的氧化应激损伤有关。第二部分铁蓄积对破骨细胞生物活性影响的研究目的:研究铁蓄积作用下破骨细胞生物活性指标的变化,探讨NF-κB通路的作用。方法:选取小鼠单核细胞系RAW264.7,在RANKL的作用下分化为破骨细胞。以50μMFAC干预,TRAP染色、噬骨陷窝实验,来检测破骨细胞的分化;q-PCR检测相关基因表达;荧光酶标仪检测破骨细胞内ROS水平;提取破骨细胞胞浆及胞核蛋白,Western-Blot检测NF-κ B通路相关蛋白表达量的差异。结果:铁蓄积可显著增加骨陷窝和TRAP染色阳性细胞数目(P<0.05);上调MMP9、Acp5、Ctsk、Calcr基因表达水平(P<0.05);同时增加细胞内ROS活性(P<0.05),使胞核蛋白p50、p65、胞浆蛋白pIκBα表达量显著增加,同时下调胞核蛋白p65、胞浆蛋白p50、IκBα表达水平(P<0.05)。结论:铁蓄积可促进骨吸收和破骨细胞的分化,该作用可能与NF-κB信号通路激活有关。第三部分小鼠铁蓄积后骨代谢指标的相关性研究目的:研究铁蓄积对小鼠骨代谢的影响及相关机制。方法:选取24只ICR小鼠(雄性),随机分成3组,分别注射生理盐水、FAC、FAC+NAC,建立对照组、铁蓄积组、铁蓄积+抗氧化剂组小鼠模型。干预完成后取各组小鼠的股骨来行HE染色,我们了解小鼠的骨小梁;应用Miro-CT对小鼠股骨远端及中段施行骨扫描,观察骨显微结构;同时留取小鼠的血清,ELISA法检测血清中的丙二醛(MDA)、铁蛋白(Ferritin)、8-羟基-鸟苷(8-OH-DG)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)、I-型胶原C端肽(CTX)、核因子κB受体活化因子配体/骨保护素(RANKL/OPG)、骨碱性磷酸酶(BALP)和骨钙素(BGP)水平。结果:铁蓄积组的小鼠的远端股骨,骨小梁较对照组稀疏,而铁蓄积+抗氧化剂组小鼠的远端的股骨骨小梁密度高于铁蓄积组;Micro-CT分析结果提示,铁蓄积组小鼠股骨远端微观结构较对照组退变明显,而铁蓄积+抗氧化剂组小鼠股骨远端骨微观结构退变较轻;铁蓄积组小鼠血清中Ferritin、MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG显著高于对照组(P<0.05),而铁蓄积+抗氧化剂组MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG显著低于铁蓄积组(P<0.05);相反,铁蓄积组小鼠血清中BALP、BGP含量明显低于对照组(P<0.05),而铁蓄积+抗氧化剂组血清中BALP、BGP含量显著高于铁蓄积组(P<0.05)。结论:铁蓄积可减少小鼠的骨量,其机制可能与氧化应激水平升高后小鼠体内骨吸收增加有关。第四部分健康女性血清铁蛋白与骨密度相关性研究目的:研究健康女性体内的铁含量随着年龄的增长与骨密度的相关性。方法:收集2015年1月至2016年12月435名22-80岁苏大附二院体检女性的骨密度与血清铁蛋白相关数据,其中血清铁蛋白,我们采用的检测方法是电化学发光法,而骨密度我们是采用双能的X线吸收仪进行测定;分组的标准是5岁年龄间隔,分别统计每个组的血清铁蛋白以及各个部位的骨密度的平均值,观察骨密度及血清铁蛋白随年龄的变化的情况;我们根据血清铁蛋白采用五等分法分类,同时根据非条件logistic回归法,分析血清铁蛋白的升高,导致骨量减少的发生风险;采用偏相关分析及多元逐步回归分析法,了解非病理状况正常人骨密度与血清铁蛋白变化的相关性。结果:血清中的铁蛋白随着女性年龄增大而升高,骨密度相反,它们两者变化的趋势在围绝经期及绝经期更加明显;混杂的因素校正后,我们五等分血清铁蛋白进行分组,非条件logistic回归法,显示出最高、最低组相比,腰椎及股骨颈骨量减少发生的OR值分别为2.83和2.09,提示随着铁蛋白增高,更容易发生骨量减少。采用多元逐步回归的方法显示,年龄、体重、血清铁蛋白和BMI是骨密度变化的相关指标,校正年龄、BMI等混杂因素后,血清铁蛋白与全身各个部位的骨密度呈明显的负相关(P<0.05)。结论:随着女性年龄的增大,血清铁蛋白逐渐升高,骨密度逐渐下降,二者之间存在显著相关性,血清铁蛋白增高时“骨量减少、骨质疏松”的发生率增大。第五部分骨质疏松患者血清铁蛋白与骨密度相关性研究目的:研究骨质疏松患者骨代谢指标与铁代谢指标的相关性。方法:根据骨密度(BMD)将117例绝经后女性患者分为正常组、骨量减少组(BL)和骨质疏松组。所有患者均测定血清生化指标,包括钙(Ca)、磷(P)、25-OH、血红蛋白、C-反应蛋白(CRP),白细胞计数(WBC)、肌酐、尿酸、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、空腹血糖;血清铁代谢指标包括血清铁蛋白(FER)和TRF,以及血清骨代谢指标包括β-CTX和PINP。结果:与正常组相比,骨量减少组和骨质疏松组的血清铁蛋白(FER)均显著升高(P<0.05)。铁蛋白水平与骨密度呈负相关。而且,铁蛋白与C-反应蛋白水平呈正相关(P<0.05)。随着女性年龄的增加,患骨质疏松的风险显著增加。BMI从正常组到骨质疏松组呈显著下降趋势(P<0.05)。骨质疏松组的抗酒石酸酸性磷酸酶水平显高于正常组(P<0.05)。在骨质疏松组中的ALP水平与正常组相比明显上调(P<0.05)。骨质疏松组的β-CTX水平明显高于正常组(P<0.05)。骨质疏松症组的PINP水平明显高于正常组(P<0.01)。血清铁蛋白和PINP之间呈明显的正相关(P<0.01),同时与血清β-CTX呈正相关。结论:铁蓄积促进了I型胶原的降解,胶原降解加速骨质疏松症的进程,同时伴随炎症反应。