论文部分内容阅读
低渗刺激可引起视上核星形胶质细胞合成释放抑制性递质牛磺酸，从而抑制神经元合成释放VP。已知脑内存在Glutamatemediatedastrocyte-neuronsignaling。SON是脑内的渗透压调节中枢之一，那么SON内是否存在Glutamatemediatedastrocyte-neuronsignaling，它在高渗刺激下是否起调节作用，其作用机制如何？为探索此问题本研究进行了三组实验（实验一、二和三）。此外，急慢性高渗刺激对胶质细胞的影响是否有所不同？我们进行了相关研究（实验四）。 实验一急性静脉高渗刺激后SON神经元的反应依赖于AST的活性 目的：观察急性静脉高渗（HS）刺激后，SON内AST和神经元的反应及其相互关系。 方法：65只SD大鼠被分为4组：第1组正常对照组(n=5)不进行任何处理；第2组为等渗刺激组(IS,n=20)，将等渗盐水（0.9％NaCl）注入尾静脉；第3组为高渗刺激组（HS,n=20）,将高渗盐水（9％NaCl）注入尾静脉；第4组为氟代柠檬酸+HS组（FCAplusHS组，n=20），预先向侧脑室缓慢注入1nmol/1m的FCA，2h后再给高渗刺激；以上动物除第1组外，其余各组均分别存活15，45，90和180min，每一时间点5只。常规灌流固定、切片，含有SON的切片进行抗VP，抗Fos，抗GFAP的单一或双重免疫荧光染色。 同时HS刺激前以及刺激后45min，抽取各组大鼠静脉血，用放免法测定血浆VP含量。 结果：1.急性静脉HS刺激后，SON内AST被激活，反应明显，表现为细胞胞体变大，突起变粗，GFAP深染，平均荧光强度增强，SON-VGL厚度增厚，Fos/GFAP双标细胞增加，以上反应在刺激后45min达到高峰。 2.刺激后SON内神经元也被激活，Fos阳性胞核明显增加，VP阳性神经元的数目也显著增加，二者的高峰均为90min。 3.FCA可明显干扰AST和神经元两者的反应。 4.刺激后血浆VP水平显著升高，FCA预先处理再给HS刺激血浆VP水平不升高。 结论：静脉HS刺激后SON内AST反应敏感，在刺激后45min达到高峰，神经元的Fos和VP表达高峰均为刺激后90min，血浆VP含量也升高。FCA是AST代谢抑制剂，以上AST和神经元的反应均被阻断；这表明SON内神经元对HS刺激的反应依赖于AST的活性。 实验二静脉HS刺激后AST经Cx43hemichannel释放Glu调节神经元活性 目的：探讨HS刺激后SON内AST对神经元的调节机制。 方法：1.整体动物实验：25只SD雄性大鼠被分为5组（5只/组）：第1组为正常对照组；第2组为IS组；第3组为HS组；第4组为FCAplusHS组；第5组为甘珀酸+HS组（CBXplusHS组）；第6组为PPADS+HS组；第7组为BBG+HS组。按实验一的方法制作动物模型，所有动物成活45min，常规固定、切片，切片进行抗NMDAR-2，抗glutamate，抗GFAP，抗Cx43，抗Fos，抗VP等单一或双重免疫荧光染色。 2.培养细胞：使用2种细胞模型： （1）原代培养的AST，取18天胎鼠的下丘脑，常规分离、纯化培养AST2周，将培养细胞分为6组：第1组为IS组（用不含Ca2+/Mg2+的DMEM培养）；第2组为HS组；第3组为缝隙连接阻断剂（CBX和Gap26)+HS组；第4组为谷氨酸转运体抑制剂（苏羟基天冬氨酸,THA）+HS组，第5组为P2Xn受体拮抗剂（PPADS以及BBG）+HS组，第6组为Ca2+螯合剂（BAPTA-AM）+HS组，各组均处理1、3、5、7、9、10、12、15min。 （2）C6细胞系，分组情况同上。 分别收上述各组原代培养的AST培养液用于HPLC检测Glu含量。而采用流式细胞仪（FCM）测定C6细胞内Glu以及Cx43含量 结果：1.整体动物实验：急性静脉HS刺激后，引起SON内下列变化： （1）AST的Glu表达明显上调，FCA干扰其上调，CBX则不干扰。（2）AST的Cx43表达明显上调，FCA干扰其上调，CBX则不干扰。（3）神经元NMDAR-2的表达明显上调，FCA和CBX均阻止其上调。（4）神经元内VP的表达上升，FCA，CBX均抑制VP的上升。 2.培养细胞实验 （1）HS刺激后，C6胞内Glu表达明显上升，3min达到高峰，以后下降。而原代AST培养液中Glu含量在5min达到高峰，此后呈下降趋势。 （2）CBX或Gap26+HS处理后，C6胞内Glu含量明显上升，并一直维持在高表达水平，而原代AST培养液中Glu含量与HS组相比，明显下降。 （3）THA+HS组，与HS组相比，培养液中Glu含量未见明显差异。 （4）PPADS或BBG+HS组，与HS组相比，细胞内和培养液中Glu含量均未见明显差异。 （5）BAPTA-AM+HS组，与HS组相比，细胞内和培养液中Glu含量均未见明显差异。 （6）培养细胞的Cx43表达也明显增加。 结论：1.静脉HS后激活SON内AST，被激活的AST增加合成Glu，并通过Cx43hemichannels释放，作用于SON神经元的NMDAR-2，增加VP的合成释放。 2.HS激活培养的胶质细胞，增加Glu和Cx43的合成，CBX或Gap26不影响Glu的合成，但可阻断其释放；THA，PPADS，BBG和BAPTA-AM对Glu的合成、释放均无明显的影响。 实验三高（低）渗刺激对胶质细胞释放递质的影响 目的：探讨HS或低渗刺激后胶质细胞释放的递质是否不同？ATP是否参与对渗透压的调控。 方法：1.培养细胞，本研究使用2种培养的胶质细胞模型：（1）原代培养的AST取18天胎鼠的下丘脑，常规分离、纯化培养2周；（2）C6细胞系。所有培养细胞分为3组：第1组为IS组；第2组为HS组；各组均处理1、3、5、10、15min。第3组为低渗刺激组；各组均处理1、3、5、10、15min。 2.分别收上述各组培养液及细胞内液，采用HPLC测定原代培养AST细胞外液Glu以及taurine含量，而用FCM测定C6细胞内Glu以及taurine含量。 3.采用荧光素-荧光素酶法检测原代培养的AST细胞内液及外液的ATP含量。 结果：1.HS刺激促进AST主要合成释放Glu，而taurine未见变化 2.低渗刺激促进AST主要合成释放taurine，而Glu未见变化 3.与等渗组相比，渗透压发生改变后，细胞内外ATP水平未见显著变化。 结论：HS刺激引起AST主要合成释放Glu，兴奋神经元释放VP。低渗刺激促进AST主要合成释放taurine，抑制神经元释放VP。而ATP未参与该调节过程。 实验四急、慢性HS刺激对SON内AST和神经元影响的差异 目的：探讨急、慢性HS刺激对大鼠行为学以及SON内AST和神经元影响的差异。 方法：1.动物分组：25只SD雄性大鼠被分为5组（5只/组）：第1组为正常对照组；第2组为2％高渗盐水喂养3d组；第3组为2％高渗盐水喂养6d组；第4组为2％高渗盐水喂养9d组；第5组为腹腔9％高渗盐水刺激组，动物成活45min。 2.一般情况检测：测定大鼠体重以及进食 3.测定各组大鼠的机械痛阈以及高级神经功能 4.免疫荣光染色所有动物规定时间点处死，常规固定、切片，切片进行抗GFAP，抗VP，抗Fos，抗Cx43等单一，双重疫荧光染色。 结果：1.急性腹腔高渗刺激45min后，SON内AST胞内GFAP与Cx43荧光强度明显上调，GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度增加，Fos/GFAP双标记细胞数目增多，同时AST的突起增长，变粗，胞体变大，呈活化型AST形态。此外VP和Fos阳性神经元的个数也显著增多。 2.喂2％高渗盐水组 （1）喂高渗盐水3d后，与对照组相比，Cx43及GFAP表达显著升高，GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度也增加，但低于急性腹腔高渗刺激组。Fos/GFAP双标记细胞数也显著增加，VP和Fos阳性神经元的个数也显著增多。此时，AST的突起有所回缩，细胞大小未见变化。 （2）喂高渗盐水6d后，Cx43、GFAP的表达下降，GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度均明显降低，Fos/GFAP双标记细胞数以及VP和Fos阳性神经元的个数也显著减少，但仍高于对照组。 （3）喂高渗盐水9d后，AST的突起回缩，胞体萎缩，Cx43、GFAP的表达明显下降，Fos/GFAP双标记细胞数，VP和Fos阳性神经元的个数也显著减少，GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度均明显降低。 （4）急性腹腔高渗刺激45min后，大鼠的机械痛阈、体重未见明显变化，而喂盐水3d后，大鼠的机械痛阈逐渐升高，体重变轻，进食量减少，至9d达到峰值，提示大鼠身体机能处于衰竭状态。明暗箱测定大鼠高级神经功能发现，大鼠学习记忆能力下降。 结论：急性和慢性高渗刺激对AST有所不同，急性刺激可以激活AST，从而参与调节神经元的活性，而慢性高渗刺激后，在早期（3d）AST及神经元的活性明显增强，到后期（6，9d）大鼠身体机能处于衰竭，反应机能明显减退，AST和神经元的反应也就被明显抑制。