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梨为蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomaceae)梨属(Pyrus L.)植物,是我国重要果树,其栽培历史悠久,栽培广泛,具有重要的经济价值和食用价值。杜梨原产于我国,是梨的主要砧木之一,具有耐寒、耐旱、耐盐碱、耐涝、耐贫瘠等抗性,适应性较强,在梨树生产中被广泛应用。目前我国土壤盐渍化程度日益严重,盐渍化面积不断增加,已成为制约梨产业发展的重要因素之一。为了探讨杜梨对盐胁迫的分子响应机理,本研究对2个盐胁迫响应的类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBLs)基因的耐盐功能进行验证;并从杜梨中分离克隆3个杜梨Na+/H+逆向转运蛋白基因,初步研究它们的序列特征、表达特点及抗逆功能。本论文的主要研究结果如下:(1)对杜梨PbCBL1和PbCBL2基因进行生物学信息分析;采用PCR和GUS染色鉴定转PbCBL1和PbCBL2基因本氏烟草株系;200 mmo1.L-1 NaCl盐胁迫下,对CBL-CIPK通路表达特点进行研究;不同浓度NaCl溶液胁迫下对转基因烟草进行表型鉴定;水培条件下研究了转杜梨PbCBL2和PbCBL2基因烟草200 mmol.L-1 NaCl胁迫下渗透调节物质和抗氧化系统的变化。结果显示:PbCBL1和PbCBL2基因基因组DNA序列长分别为2969 bp和1927 bp,对应cDNA序列长度分别为642 bp和681 bp,分别编码了 213和226个氨基酸,均由8个外显子和7个内含子组成。PCR和GUS染色结果表明,PbCBL1和PbCBL2基因已成功转入本氏烟草。CBL-CIPK信号通路表达情况研究表明,其下游部分相关基因表达上调。盐胁迫处理30d后,可以明显地看出烟草植株长势依次在减弱;300 mmol.L-1 NaCl和500 mmol.L-1 NaCl处理时,盐胁迫对烟草植株生长抑制明显,与ck相比,转基因株系株高、根长、叶片数目、重和鲜干重都显著较高。200 mmol.L-1NaCl胁迫3d后,转基因烟草叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、的活性较对照先增强后减弱,渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量显著增加,丙二醛含量(MDA)显著升高,活性氧(O2-)含量显著降低;转基因烟草中Na+含量显著升高,K+含量降低幅度显著较小。这些结果说明,PbCBL1和PbCBL2基因提高了烟草的耐盐性。(2)采用电子克隆、RT-PCR和长片段PCR克隆了PbNHX1的cDNA和DNA序列,利用生物信息方法学进行序列分析,定量PCR检测其在非生物胁迫下转录水平变化,酵母互补试验检测PbNHX1基因的离子转运能力。结果显示,杜梨PbNHX1基因cDNA编码区长1704 bp,对应基因组DNA序列长3594 bp,由13个外显子和12个内含子组成,编码蛋白含567个氨基酸。系统进化树显示PbNHX1位于液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白分支上,与杨树液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白PtNHXl.3基因亲缘关系较近。施加 200 mmol.L-1NaCl、10%w/v PEG6000 或 100 μmol.L-1ABA 后,PbNHX1在叶片中的转录水平持续上升;其在根中的表达量先升后降,表达高峰依次出现在处理6h、3h和6h。PbNHX1的转入可恢复NaCl、KC1和潮霉素B对nhx1缺失酵母菌株AXT3的生长抑制,转基因酵母细胞中Na+和K+含量显著增加。PbNHX1基因具备植物NHXs基因家族的固有特征,对盐碱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录上调响应,酵母互补实验证实,过量表达PbNHX1基因可恢复NaC1、KCl和潮霉素B对nhx1缺失酵母菌株AXT3的生长抑制,部分恢复其对阳离子的转运功能,从而促进Na+、K+积累。(3)本研究中,从盐胁迫杜梨幼苗转录组数据库中鉴定出两个新型NHX2基因。克隆和测序后,分别命名为PbNHX2.1和PbNHX2.2。经过系统进化分析,PbNHX2s具有典型的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因结构,存在相同的保守功能结构域,被分为同一类NHX基因。和AtNH2相似,PbNHX2s定位在植物细胞液泡膜上。PbNHX2.2 mRNA的转录普遍存在植物的根、茎和叶中,但主要在根中表达。PbNHX2./在上述3个组织中表达量较低。NaCl或PEG处理后,幼苗PbNHX2.1和PbNHX2.2稳态mRNA水平以相似的方式上升,但是,PbNHX2.2在根、茎和叶中的转录水平显著高于PbNHX2.1。两种转录本的积累是由于响应脱落酸(ABA),这表明PbNHX2s基因对盐和渗透胁迫的响应可能依赖于ABA途径。酵母重组实验表明:PbNHX2.1和PbNHX2.2可以使缺失胞质或细胞质Na+/H+逆向转运蛋白基因ScNHX1,Na+敏感型酵母突变体AXT3的生长得以恢复。离子积累实验证明:PbNHX2s蛋白质具有促进Na+离子区域化和胞内K+动态平衡的功能。这些结果表明:PbNHX2.2是耐盐性决定因,其一个主要功能是Na+的液泡化。