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食品安全问题是一个日益突出的社会问题,它关系到我国千千万万人民群众切身利益,关注食品安全势在必行。食源性致病菌是目前最常见的,有巨大危害性并且影响广泛的食品污染因素。因此,建立便捷、快速和灵敏的食源性致病菌检测方法对预防食品安全问题的发生和保护人类健康具有重要意义。大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌作为常见的食源性致病菌,本文介绍了以下几种检测大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌的方法:(1)基于分子扩增原理的死、活菌鉴定方法的建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与食源性致病菌细胞孵育,正常情况下PMA不能透过完整的细胞膜,而对于死亡的细胞,其细胞膜上有退化或结构有损坏,所以PMA会选择性地进入死亡细胞的内部与其DNA结合。再将用PMA处理过的食源性致病菌样品暴露在特殊强光下一定时间,PMA会嵌入DNA分子的双链中致使DNA分子的永久修饰。并且这种DNA的共价修饰会抑制聚合酶的活性,进而阻断DNA分子的聚合酶链式反应(PCR),因此来自非存活或者膜受损细胞的DNA则无法通过PCR进行扩增。经过实验条件的优化,使用终浓度为5μg/mL的PMA与食源性致病菌样品孵育5分钟后在500 W卤素灯下曝光5分钟,可以使PMA对DNA的PCR扩增起到最大抑制作用。利用该方法可以判断食源性致病菌的死活状态,并为进一步选择和建立食源性致病菌的检测方法做铺垫。(2)基于磁性富集增敏型侧向层析试纸条检测大肠杆菌O157:H7的研究基于抗原抗体的免疫识别,在金纳米粒子(AuNPs)表面标记大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体作为识别探针结合细菌,再被检测线(T线)上固定的另一株大肠杆菌O157:H7抗体捕获形成双抗夹心结构,金纳米粒子被固定在T线上使其显线,标记了抗体的金纳米粒子被固定在质控线(C线)上的羊抗鼠二抗捕获,从而C线显线。通过肉眼观察T线的显色强度初步定量分析待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。在此基础上,增加一步利用标记大肠杆菌O157:H7抗体的磁性纳米粒子(MNPs)对待测样品进行磁性富集,然后再应用胶体金免疫侧向层析试纸条进行检测。在最优实验条件下,传统型侧向层析试纸条的检测灵敏度可以达到4.1×10~4cfu/mL,相比之下,磁性富集增敏型侧向层析试纸条将检测灵敏度提高100至1000倍,肉眼可以检测到10~1 cfu/mL的大肠杆菌O157:H7,同时具有良好的检测线性和检测特异性。(3)基于PCR技术的大肠杆菌O157:H7毒力基因检测研究毒力基因,作为细菌DNA中特定的片段,每一种细菌都有其独有的毒力基因,因此可以在分子层面检测毒力基因,从而实现对特定细菌的检测。基于此,我们首先利用磁性纳米粒子提取出大肠杆菌O157:H7的DNA,再利用针对大肠杆菌O157:H7毒力基因(rfb)的特异引物对其进行PCR扩增。最后应用琼脂糖凝胶电泳表征PCR产物,通过肉眼观察目标产物电泳条带的强度初步定量分析待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。经过实验条件的优化,PCR扩增可以检测到3×10~2cfu/mL大肠杆菌O157:H7,同时具有良好的检测特异性。(4)基于侧向层析荧光试纸条检测大肠杆菌O157:H7毒力基因的研究基于抗原抗体免疫识别和链霉亲和素(SAV)与生物素(biotin)的特异识别,在毒力基因正反向特异引物的5’端分别修饰生物素和异硫氰酸荧光素(FITC),再应用PCR对毒力基因进行扩增,得到两端分别标记有biotin和FITC的产物。将PCR产物滴加到荧光试纸条上进行检测,PCR产物会先结合表面标记FITC抗体的荧光微球,再被T线上固定的SAV捕获,紫外光照射下T线显线。标记了FITC抗体的荧光微球被固定在C线上的羊抗鼠二抗捕获,紫外光照射下C线显线。通过肉眼观察T线的荧光强度可以初步定量分析待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。在最优实验条件下,侧向层析荧光试纸条在标准样品和实际样品中可以分别检测到3 cfu/mL和3×10~1 cfu/mL的大肠杆菌O157:H7,与琼脂糖凝胶电泳结果相比,该方法将检测灵敏度提高了2个数量级,同时具有良好的检测线性和检测特异性。(5)基于异质识别体系的夹心法平板比色检测空肠弯曲菌研究基于经典的全菌SELEX方法首次筛选出空肠弯曲菌的核酸适配体,再利用所选核酸适配体和空肠弯曲菌的抗体,构建抗体-适配体异质识别体系的夹心法平板比色检测空肠弯曲菌。通过形成夹心结构,辣根过氧化物酶(HRP)被固定到微孔中,最后加入TMB显色底物进行显色反应,肉眼观察微孔中液体的颜色变化可以初步定量分析待测样品中空肠弯曲菌的浓度。然后用浓硫酸终止反应,在应用酶标仪测量微孔中液体的光学强度值可以定量分析待测样品中空肠弯曲菌的浓度。经过筛选和分析,得到序列A1(5’-CTGCGATCAAGTTACGCACCTCGCCATGTT CCCCGCCCGGCATGTGTTATGCCCCTGTG-3’)与空肠弯曲菌有最好的结合能力,所以选择序列A1作为空肠弯曲菌的核酸适配体。在最优实验条件下,异质识别体系的夹心法可以检测到13 cfu/mL的空肠弯曲菌,同时具有良好的检测线性和检测特异性。这也进一步说明该研究中所筛选出的空肠弯曲菌核酸适配体具有良好的性能。