唾液中运动性疲劳相关代谢标志物的毛细管电泳检测方法研究

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随着人民对生活水平和身心健康要求的提高,关于运动健康的研究越来越受到重视,而在分析化学领域,开发出检测人体体液代谢指标物的分析测试方法显得愈发重要。本研究拟采用运动员唾液为对象,在自然状态下、不同运动强度导致疲劳的模式训练前后、以及高原训练下唾液的采集,同时采用目前运动员机能监控中一些常用评价指标如心理问卷和生理生化指标测试方法记录和评价不同运动模式对运动员的疲劳程度的分析判定;探寻唾液中与运动性疲劳相关的新的生化代谢产物,如一氧化氮代谢物与中枢神经递质,毛细管电泳技术具有分析速度快,精密度高,环境友好,对于体积小且珍贵的样本,能够提供很高的分离效率,能够满足人体代谢标志物的检测需求。
  利用毛细管电泳分离技术对唾液中运动性疲劳相关代谢产物的探寻,在定性和定量的基础上,结合目前的一些传统评判手段,开发出灵敏度高,用时较少,同时检测多组分的新分析方法。通过数据相关性分析发现唾液中代表运动性疲劳的标志物,揭示运动性疲劳的某些生化代谢机制,并将代谢指标物在运动训练实践中加以应用和验证。因此全文分为五章:
  第一章首先分别介绍了毛细管电泳技术(Capillary electrophoresis,CE)概述及发展,构造与基本原理,相关概念,进样方式,分离模式,检测器种类,以及方法应用领域。其次对中枢神经递质进行了概述,介绍其分类与生命调节的作用。接着对运动性疲劳生物标志物的研究进展进行文献综述,随后是毛细管电泳技术在唾液分析中的应用,最后,详细阐述了本课题研究的目的与意义。
  第二章开发了一种能够快速直接测定人类唾液样本中的无机阴离子(NO3?,NO2?,SCN?)的测试方法。分别考察了背景电解质(Background electrolyte,BGE)的成分浓度与酸碱度,分离电压,进样时间等因素对分析测试结果的影响,确定了最优化的实验条件,实验结果表明,检测波长为200nm,分离电压-15kV,进样时间10s,运行缓冲溶液:盐酸-6-氨基己酸,浓度10mmol/L,pH4.3,0.1%(m/v)羟丙基纤维素。在该条件下,三种阴离子在14min内实现分离。在1.0-500.0μg/mL范围内,三种待测分析物展现出良好的线性相关关系,且线性相关系数在0.9902之上,分析物的迁移时间和峰面积的RSD值分别为0.40%-1.10%,1.20%-3.40%。加标回收率为89.2%-98.7%。开发的分析方法可以直接测定目标物唾液中一氧化氮的代谢产物,不需要复杂的衍生化过程,能够有效的规避常见的共存有机和无机的代谢物,为人体体液检测提供了一种可供参考的方式。并分析了运动员力竭前后的唾液样本,首次发现当运动中枢疲劳时会导致唾液中硝酸根和亚硝酸根的含量发生改变。且唾液中硫氰根离子可以分辨出吸烟与否,为运动疲劳标志物研究带来新思路。
  第三章建立了一种毛细管电泳通用型紫外检测器对单胺类神经递质、神经递质类前体物质的分析方法,采用硼砂-氢氧化钠作为缓冲液同时测定六种神经递质类物质(5-HT,DA,EP,NE,Trp,Tyr),研究了缓冲液的组成,缓冲液pH,分离电压,进样时间等因素对6种标样混合物分离的影响。最终确定最优条件为:缓冲溶液浓度种类为:25.0mmol/L Na2B4O7-NaOH,pH为10.16(0.1mmol/L NaOH调节),在50mbar压力下进样10s,分离电压为+15kV,检测波长在200nm。在此最佳条件下,待测分析物在14min之内可以完成基线分离。在最优实验条件下考察了方法的重现性、线性范围和检出限,LODs在0.12-0.5μmol/L之间,迁移时间与峰面积的RSD分别在0.20~3.34%与1.05~4.87%之间,该方法能够满足定性、定量分析要求。为分析运动员实际唾液样品中代谢产物指标奠定了基础,为后续的代谢组学研究的发展提供了新的途径。
  第四章将已开发的方法对实际唾液中多种神经递质类物质进行定性定量分析。在实际唾液样本中进行加标实验,结果显示,分析物6种神经递质类物质加标回收率为88.40%-103.60%之间,该方法准确可靠,可推广于普通人唾液的神经递质类物质分析和运动代谢的监测。研究首次发现大强度力竭训练后,唾液中5-羟色胺,肾上腺素含量上升,而多巴胺,色氨酸,酪氨酸的含量下降,与前人以血液样本和动物实验的结果相互符合,说明了运动时细胞膜的通透性会增大,血液中的代谢物能穿透细胞膜和粘膜进入人体唾液中,从而引起唾液成分浓度的变化,因此唾液中的相关代谢成分与血液中代谢物有很好的相关性。本文还结合了分析化学与代谢组学,对酪氨酸的代谢通路进行了探讨,对大强度训练、高原训练前后代谢物含量差异进行解释,酪氨酸含量变化将会直接导致多巴胺与肾上腺素等儿茶酚胺类物质的含量变化。
  第五章阐述了本课题研究的结论与展望。
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