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星状病毒(Astrovirus,AstV)是单股正义的RNA病毒,主要感染哺乳类和禽类动物,同时也是一种人畜共患病病毒。猪星状病毒在猪群中感染率较高,在世界各地均有分布。星状病毒变异较快,且诸多证据表明毒株之间可以发生重组。系统发育分析和蛋白解析发现,星状病毒是一种快速进化的病毒,它通过复制选择重组交换其衣壳的部分结构域,产生细胞嗜性的扩展。显然该病毒具有跨种间传播及适应新宿主的能力,与此同时星状病毒也有许多新型的临床症状,如脑炎、痛风等相关。本研究利用生物信息学的方法,对星状病毒中两个未知蛋白的结构和功能进行预测,并基于猪星状病毒反向遗传操作系统,探究两个蛋白对病毒生物学特性的影响。1.猪星状病毒ORFX和ORFY蛋白的结构与功能预测及多克隆抗体的制备本研究通过生物信息学的方法对星状病毒的基因组进行分析,发现两个潜在的开放阅读框ORFX和ORFY,并对ORFX和ORFY编码的蛋白进行结构和功能的预测。ORFX与ORF2的5’端重叠,与ORF2的起始密码子间隔7个氨基酸;ORFY位于ORF2编码的保守区P1结构域,与ORF2的起始密码子间隔约299个氨基酸。利用蛋白质库和相关服务器对蛋白质的各级结构进行模拟与演算,了解到蛋白的理化性质、亲水性、跨膜区和二级结构域,最终建立了蛋白质的三级结构模型。根据预测的结构可以发现,ORFX中19-45aa氨基酸序列与蛋白质库中c3j9dA蛋白部分氨基酸序列的三级结构较为相似,此蛋白存在于蓝舌病病毒VP2中,根据c3j9dA蛋白推测ORFX蛋白的作用主要是作为病毒进入宿主时的pH传感器(pH sensor)。ORFY中I-62aa氨基酸序列与蛋白质库中c5nbhB蛋白羧基末端较为相似,据此可以推测ORFY蛋白可能与宿主细胞的结合相关,这或许为星状病毒的受体寻找提供了方向。为鉴定ORFX和ORFY是否能够编码病毒蛋白。对ORFX和ORFY的基因片段进行扩增,通过同源重组的方法,构建了 pET-B2M-ORFX和pET-32a-ORFY的原核表达载体。将测序正确的阳性质粒分别转化至E.coli.Rosseta和E.coli.BL21感受态细胞中,获得含重组质粒的菌株。经SDS-PAGE检测,发现两个蛋白均为包涵体蛋白。将表达的蛋白进行纯化,当蛋白浓度和纯度达到要求后即与佐剂混匀形成合适的免疫原。最后通过皮下注射的方式,免疫新西兰大白兔。每周免疫一次,免疫五次后进行心脏采血,分离出血清,获得抗ORFX和ORFY的抗体。制备的抗体经IFA检测发现两个多克隆抗体分别可以与猪星状病毒感染的细胞中表达的ORFX和ORFY蛋白发生特异性结合。说明猪星状病毒感染细胞后,开放阅读框ORFX和ORFY能够表达出预测的蛋白。2.pT7-ORFX和pT7-ORFY突变株的构建和拯救在构建的猪星状病毒pT7GX1感染性克隆基础上,通过突变PCR定点突变ORFX和ORFY的起始密码子,构建了 pT7-ORFX和pT7-ORFY两个突变克隆。同时对野生型pT7GX1和pT7-ORFX、pT7-ORFY突变克隆进行拯救,结果发现野生型pT7GX1和突变株pT7-ORFX在第五代出现了病变,而突变株pT7-ORFY却未出现病变,直到第8代才出现病变。通过IFA鉴定,在pT7-ORFX突变株中未出现ORFX蛋白的表达,在pT7-ORFY突变株中未出现ORFY蛋白的表达。据此可以推测,猪星状病毒中存在这两个蛋白,通过对病毒的RNA拷贝数进行定量检测,发现在12-24h间野生型毒株rT7GX1病毒RNA呈高效地复制,但是两个突变株12-24 h病毒RNA复制时并未有大幅度地提高,反而在24-48 h之间才出现了较高效率的复制。通过生长曲线可以发现,野生型毒株pT7GX1相比突变株pT7-ORFX和pT7-ORFY而言具有更高的病毒滴度,同样突变株pT7-ORFX的病毒滴度又高于突变株pT7-ORFY。且ORFX蛋白和ORFY蛋白在病毒复制的前中期对星状病毒RNA的复制相关,这些结果表明ORFX蛋白和ORFY蛋白对病毒的活性(viability)是非必须的,但是他们的缺失对病毒的复制有一定的影响。