研究背景:胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,近几年来其发病率逐年递增。胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)被认为是胶质瘤中恶性程度最高的肿瘤之一,约占颅内肿瘤的15%,常常起源于正常的脑细胞或低级别星形细胞瘤,每年发病率大约为3/10万人。胶质母细胞瘤治疗是困扰当今世界的一大难题,通常来说,GBM患者在明确诊断后,其生存时间约12-18个月,仅3-5%的患者生存时间超过5年。目前,国内外学者提倡对GBM进行一些综合性治疗,即包含一系列方法,如手术切除、放疗、化疗和基因靶向治疗等等,然而大部分患者的临床疗效并未达到预期。肿瘤细胞的增殖、侵袭以及转移和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)机制是近年来一些肿瘤,如肠癌,胃癌及肺癌等研究领域的热门和难点,遗憾的是,当前胶质瘤的基础或者临床研究中仍无突破性进展。因此,进一步探索GBM的发生、发展以及恶性变的分子机制,寻找新的治疗靶点,以期开展临床方面的治疗。转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一组负责调控细胞的生长、分化和增殖的多效性细胞因子。其中转化生长因子β1(TGF-β1)是TGF-β超家族中的一种多功能的生长调控因子,之前的研究主要集中在其参与炎症、组织修复方面,近几年来研究发现,TGF-β1与细胞的分化、生长与发育等密切相关。有研究证实TGF-β1参与了许多肿瘤细胞的调控作用,但其在胶质瘤中的作用比较复杂,机制尚未明确。目前,TGF-β1与胶质瘤的恶性程度之间的相关性如何,国内外研究仍存在较大争议。在所有类型的细胞中TGF-β1首先以无活性的形式合成并分泌,然后磷酸化激酶作用下活化后与不同的受体结合,进一步启动细胞内信号的产生,表现出多样的生物学活性。在多种体外肿瘤细胞或者组织块研究中,TGF-β1出现高表达,并能使细胞增殖减缓,然而在体内却无效,其分子机制尚不清楚。有研究表明,TGF-β1的肿瘤生长调节作用与结合的受体直接相关,与细胞膜上不同的受体结合,则发挥的作用不同。许多细胞表面都有TGF-β受体(Transforming Growth Factor Beta Receptor,TGFBR),哺乳动物TGF-β受体主要分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3种形式,其中Ⅰ、Ⅱ型TGFBR是TGF-β1主要受体。TGFBR的表达水平的改变,基因的突变或功能的缺失均影响TGF-β1信号通路的传导。活化素受体样激酶1(Activin receptor-like kinase 1,ALK1)是Ⅰ型受体中重要类型,主要表达于内皮细胞及骨髓基质细胞,研究认为在细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程中,TGF-β1均参与调节。有文献报道TGFBR2基因突变或者表达程度改变是肾癌,结肠癌,胃癌等表型改变或恶性进展的重要原因。Ⅲ型TGF-β受体缺乏蛋白激酶的活性,作用机制尚不清楚。TGF-β1首先与细胞膜表面的Ⅱ型受体以二聚体形式形成二元复合物,但此复合物没有活性,需要I型受体被磷酸化激酶活化后,并识别结合该二元复合物,共同形成异四聚体进入受体细胞内,最终通过磷酸化Smad启动胞内的信号转导,引起级联的反应,启动TGF-β1信号转导通路。整个过程中TGF-β与受体结合可能是TGF-β信号通路的起始点或者关键点。mi RNAs(micro RNAs,mi RNAs)是一类内源性非编码的小RNAs,约22个核苷酸大小,其机制是通过与靶基因m RNA的3’-UTR碱基互补配对后抑制m RNA的翻译过程或使靶向m RNA降解,在转录及转录后水平抑制靶基因的表达,调控靶基因的生物学功能。mi RNA的生物学功能众说不一,研究发现mi RNAs几乎参与细胞的生长发育的所有进程,目前研究主要集中于生命体的生长、发育,细胞的分化、凋亡,肿瘤细胞形成等方面。在一些恶性肿瘤研究中证实mi RNAs可作为原癌基因或抑癌基因发挥作用,mi RNAs的表达失调与肿瘤的进展密切相关。如何鉴定出这些mi RNAs功能和探究其潜在靶点机制,有效利用mi RNA成为恶性肿瘤的诊断、进展、恶性病和预后的生物学标记物,并针对这些差异性表达的mi RNAs设计更有效的肿瘤治疗靶点是当前研究的重点。信号通路与mi RNA的作用相辅相成,相互作用。许多信号通路如P53,Wnt,TGF-β等对mi RNA的转录、加工成熟以及功能发挥调控作用,蛋白质也可以被mi RNA所靶向调节,一起作用信号通路。如在成骨细胞,平滑肌细胞的分化研究中发现mi R-23可通过调节TGF-β1信号通路发挥重要作用。另外也有研究报道TGF-β信号通路可以增加mi R-200基因的甲基化水平,进而影响其表达水平,从而调节细胞的上皮-间质转化过程。在脑胶质瘤研究中通过mi RNAs表达谱对比分析中发现存在多种mi RNAs差异性表达变化,如原癌基因mi R-21的升高,抑癌基因mi R-31等下调,但这些mi RNAs如何导致肿瘤进展及恶性转化的具体机制尚不清楚。有文献报道,mi R-664(micro RNA-664,mi R-664)表达异常与骨肉瘤、乳腺癌和宫颈癌等肿瘤形成确切相关。然而,mi R-664在胶质母细胞瘤中扮演何种角色以及与TGF-β1信号通路的关系仍不明确。因此,本课题拟首先阐明胶质瘤组织中ALK1,TGFBR2以及TGF-β1的表达水平与胶质瘤病理分级的相关性;在此基础上明确胶质母细胞瘤组织及细胞株中mi R-664表达水平,分析mi R-664表达水平的变化对胶质瘤的细胞迁移、侵袭以及EMT相关蛋白的影响,探讨mi R-664与TGF-β1的作用关系。通过我们对mi R-664作用靶基因进行研究,拟探索mi R-664在胶质母细胞瘤发生发展中的潜在分子机制。第一部分人脑胶质瘤中TGF-β1及其Ⅰ,Ⅱ型受体(ALK1,TGFBR2)表达水平检测与临床病理相关性分析。目的:TGF-β1是一种组织细胞多效性生长调控因子,对细胞生长起调节作用。TGF-β1及其受体在胶质瘤组织的表达水平文献报道不一,与病理级别相关性尚不完全明确。本实验拟利用临床手术收集的胶质瘤标本,采用RT-PCR,Western Blot和免疫组化等技术检测胶质瘤手术标本中TGF-β1、ALK1及TGFBR2的m RNA和蛋白表达水平,并分析这种表达水平的变化与胶质瘤的病理分级的相关性。方法:1.收集病例资料及手术标本:选取手术证实的胶质瘤患者的组织标本,获取的样品立即放入液氮中冷冻保存。所有病人的信息获取及知情同意均通过南昌大学第一附属医院伦理委员会批准。2.病理分级及分组:手术标本病理结果通过两位病理学专家证实,按照WHO分级。分为:Ⅰ级组,Ⅱ级组,Ⅲ级组,Ⅳ级组。正常对照组及胶质瘤组都是通过捐献者获取。3.总RNA提取及RT-PCR检测:取无菌条件下保存于液氮罐冻存管中脑胶质瘤标本及正常组织,提取总RNA,并行RT-PCR分析,检测不同组中TGF-β1、ALK1及TGFBR2的m RNA表达水平的变化。4.总蛋白提取及Western blot检测:新鲜脑胶质瘤标本及正常组织,提取总蛋白,定量后行Western blot分析,检测不同组标本中TGF-β1、ALK1及TGFBR2的蛋白表达水平的变化。5.免疫组织化学检测:依据免疫组织化学SP试剂盒的步骤,各组的胶质瘤标本予脱蜡、甲醛的固定及内源性过氧化物酶及血清封闭后,免疫组织化学检测TGF-β1、ALK1及TGFBR2的表达情况。采用双盲法观察计数阳性细胞数,计算阳性率。6.数据处理和统计分析:所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析,实验组均进行方差齐性分析,均数比较采用两样本的t检验,采用spearman非参数相关检验做相关分析。结果:1.不同病理分级标本中TGF-β1的m RNA和蛋白表达趋势:与正常组相比,Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级组TGF-β1的m RNA表达升高,但差别无统计学意义(P>0.05);胶质瘤Ⅳ级组m RNA的表达显著的升高,差别有统计学意义(P<0.05)。而TGF-β1的蛋白表达在正常组及Ⅰ级组表达低下或不表达,而Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组表达明显升高,差别有统计学意义(P<0.05);不同病理分级标本中TGF-β1的m RNA和蛋白表达水平呈现不一致性。2.不同病理分级标本ALK1和TGFBR2的m RNA和蛋白表达趋势:各组脑胶质瘤标本中ALK1、TGFBR2的m RNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组ALK1和TGFBR2 m RNA和蛋白表达与正常对照组相比差别有统计学意义(P<0.01),随着病理分级,蛋白表达有递增趋势。3.免疫组化分析:正常组几乎不存在TGF-β1表达,但有ALK1、TGFBR2表达,Ⅰ级组和Ⅱ级组TGF-β1表达处于低水平,Ⅲ-Ⅳ级组表达明显升高(P<0.05)。不同组均存在胞质内有棕黄色或褐色颗粒的ALK1、TGFBR2染色阳性细胞而对照组少见染色阳性的细胞。与对照组比较,各级别组ALK1阳性细胞百分率差异有统计学意义(P<0.05)。而各级别组TGFBR2阳性细胞百分率差异有显著统计学意义(P<0.01)。4.Spearman秩相关分析显示ALK1和TGFBR2蛋白表达均与肿瘤病理分级呈正相关,其中ALK1(r=0.297,P<0.05)以及TGFBR2(r=0.371,P<0.05)。而TGF-β1的表达与病理分级存在不一致性。结论:1.正常组及低级别脑胶质瘤组中均存在TGF-β1的m RNA表达,但蛋白表达水平较低甚至无表达,随着胶质瘤病理分级增高,TGF-β1的m RNA和蛋白表达水平逐渐升高,但存在不一致性,在TGF-β1表达的异常与胶质瘤的恶性程度无明显相关性。2.脑胶质瘤组中ALK1、TGFBR2的m RNA和蛋白都存在表达上升趋势,与胶质瘤的病理分级具有相关性。脑胶质瘤组TGFBR2的表达升高幅度明显高于ALK1,同时其高表达与胶质瘤的病理分级呈相关性,可能参与胶质瘤恶性变。第二部分Micro RNA-664过表达调控TGF-β信号通路抑制胶质细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的机制研究目的:mi R-664表达异常与乳腺癌、骨肉瘤和宫颈癌等肿瘤形成有关。另文献报道mi RNAs表达异常可影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,其机制之一有可能是通过TGF-β1信号通路起作用。我们本课题设想mi R-664在胶质母细胞瘤发生发展中也发挥作用,并验证其可能与TGF-β1的关系及相关分子机制。本实验首先拟通过q RT-PCR和Western blot检测GBM组织和细胞株中mi R-664的表达水平改变的情况,并观察mi R-664过表达对胶质瘤细胞迁移、侵袭和EMT相关蛋白(N-cadherin,E-cadherin和Vimentin)表达的影响。接下来,本实验拟对mi R-664作用靶点进行研究,并探讨mi R-664与TGF-β1及其TGFBR2受体的关系,以研究其在GBM发生发展中的潜在分子机制。方法:1.收集病例资料及手术标本:选取我院手术证实的GBM患者病例。每个患者由两位病理学专家证实检查结果。正常脑组织及GBM组织都是通过捐献者获取。获取的样品立即放入液氮中冷冻备用。所有病人信息的获取及知情同意均通过南昌大学第一附属医院伦理委员会的批准。2.细胞培养:获取胶质瘤细胞株U87-MG和T98G及正常星形细胞株HEB,待细胞复苏后放在含10%胎牛血清的DMEM培养液,并置入5%CO2 37℃恒温培养箱中培养,细胞呈贴壁生长状态。3.化学合成mi R-664 mimic,mi R-664 scramble和TGFBR2-si RNA:登录mirbase.org库查找最新mi R-664序列,化学合成mi R-664 mimic,mi R-664scramble和TGFBR2-si RNA。4.转染:按Lipofectamine 2000的使用说明书对胶质瘤细胞株U87-MG、T98G和正常星形细胞株HEB进行转染。5.q RT-PCR和Western blot检测:在正常脑组织、脑胶质母细胞瘤以及胶质瘤细胞株(U87-MG、T98G及HEB)中提取总RNA及总蛋白,采用q RT-PCR和Western blot技术检测各组组织或细胞中mi R-664和TGFBR2的m RNA和蛋白表达水平。U87-MG、T98G及HEB细胞株分别转染mi R-664 mimic,mi R-664scramble和TGFBR2-si RNA培养48h后提取细胞总RNA和总蛋白检测各组细胞EMT相关蛋白(N-cadherin,E-cadherin和vimentin)的m RNA和蛋白的表达水平改变情况。6.Transwell检测:制备无基质胶Transwell小室,胶质瘤细胞株(U87-MG、T98G及HEB)分别转染mi R-664 mimic,mi R-664 scramble和TGFBR2-si RNA,无血清培养24h,制备细胞悬液,接种在小室,检测转染si RNA或者质粒后不同组穿过小室PET膜的细胞数,评估其细胞迁移及侵袭能力。7.荧光素酶报道基因检测:化学合成含靶基因TGFBR2-3’-UTR片段,构建双荧光素酶报告基因的质粒,将构建好荧光素酶报道基因质粒TGFBR2-WT(野生型TGFBR2 3′-UTR结合位点)以及TGFBR2-Mut(突变型TGFBR2 3′-UTR)共转染细胞株。采用双荧光试验报告系统测定细胞转染质粒后48小时荧光素酶的活性,检测mi R-664与TGFBR2基因相互作用。8.数据处理及统计学分析:所有计数资料都用均值±标准差(SEM)。独立样本两组间差异输入graph prism 5.0软件(Graph Pad Prism,San Diego,CA)进行t检验分析,3组以上的差异用方差分析(ANOVA)。P<0.05被定义为有统计学意义。结果:1.mi R-664在胶质母细胞瘤组织和细胞株中的表达:在胶质母细胞瘤和正常脑组织中以及在胶质母细胞瘤细胞株和正常人类星形胶质细胞株都存在mi R-664和TGFBR2的m RNA和蛋白的表达,检测其相对表达水平发现mi R-664在胶质母细胞瘤组织中比在正常组织和细胞中均明显下降(P<0.01)。此外,TGFBR2的m RNA及蛋白表达水平在胶质母细胞瘤组织和细胞中都明显高于正常组织和细胞(P<0.05)。2.mi R-664过表达抑制细胞迁移和侵袭:Transwell法测定mi R-664在胶质母细胞瘤的细胞迁移和入侵中所起的作用。结果表明:胶质母细胞瘤的细胞迁移数量在mi R-664 mimic中比在mi R-664 scramble组和对照组中显著减少(P<0.05)。同样,在mi R-664 mimic组中侵入胶质母细胞瘤的细胞数目明显小于mi R-664 scramble和对照组(P<0.05)。3.mi R-664过表达调控EMT相关蛋白的表达:当mi R-664过表达时,U87-MG和T98G细胞中E-cadherin的表达显著增加(P<0.05)。与此相反,在mi R-664 mimic组的两组细胞株中,N-cadherin和vimentin的表达水平比在其他两组显著降低(P<0.05)。4.TGFBR2是mi R-664的作用靶点:我们预测两种细胞株U87-MG和T98G中mi R-664均可与TGFBR2靶基因序列相互作用及作用位点。构建质粒转染后在双荧光素酶活性检测中发现,与对照组相比,在含野生型3’′-UTR的TGFBR2的U87-MG和T98G细胞株中转染mi R-664 mimic组,荧光活性显著下降(P<0.05)。然而TGFBR2 3’-UTR预结合位点的突变使mi R-664失去相应的靶序列,使含TGFBR2-Mut细胞株免受mi R-664的抑制作用,荧光素酶活性无影响。此外,TGFBR2的m RNA和蛋白表达在mi R-664 mimic组中比在mi R-664 scramble和对照组中显著降低(P<0.05)。实验也证实TGFBR2的m RNA和蛋白表达在TGFBR2-si RNA转染细胞后显著下降。5.mi R-664的过表达通过TGF-β1信号通路调控细胞侵袭和迁移:发现TGFBR2抑制和mi R-664过表达均可显著抑制胶质母细胞瘤的细胞侵袭和迁移(P<0.05)。此外,当mi R-664 mimic组与si-TGFBR2结合时,其抑制作用最优(P<0.01)。而mi R-664 mimic组与si-TGFBR2都可以增加E-cadherin的表达并降低N-cadherin和vimentin的表达(P<0.05),尤其是当mi R-664mimic组结合si-TGFBR2(P<0.01)。结论:1.在胶质母细胞瘤组织和细胞株中内源性mi R-664的m RNA和蛋白表达水平低,可能与胶质瘤的发生发展相关。2.mi R-664过表达可有效抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭并改变其上皮-间质转化趋势。3.mi R-664可能通过TGF-β信号通路抑制肿瘤侵袭和迁移,调节其上皮-间质转化。其中TGFBR2可能是mi R-664作用于TGF-β信号通路的直接靶点。