背景和目的：　　人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染可导致尖锐湿疣、扁平疣、寻常疣等病毒性皮肤病，高危型HPV还与子宫颈癌发生密切相关。但是，目前针对HPV感染所致疾病的复发缺少有效手段，难以根除潜在的感染。改变局部病灶持续存在病毒的状况，对于疾病复发和子宫颈癌的发生具有重要的防治作用。机体在抗胞内感染的过程中，细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）发挥着重要的作用。利用CTL对感染细胞进行特异性杀伤，已经成为治疗胞内病毒感染的有力手段。故发展能有效地在体内诱导CTL反应的疫苗形式是近年来胞内病毒感染等疾病免疫学治疗方面倍受关注的核心问题。HPV E6或E7分子是子宫颈癌的重要致瘤基因，目前对于子宫颈癌的疫苗研究大多是针对这两个靶点。基于HPV16 E6或/和E7靶抗原的DC疫苗和外泌体疫苗是在体内激活抗HPV感染的CTL应答较为有效的形式，但都有待于进一步完善。　　外泌体作为一种细胞来源的粒子，可在多种体液中或者细胞上清液中存在。无论是肿瘤细胞来源外泌体（Modified tumor cell-derived exosomes，TEXs）还是树突状细胞来源外泌体（Dendritic cell-derivedexosomes，DEXs）都能作为有效疫苗种类。肿瘤抗原未被专职抗原呈递细胞（professional Antigen Presenting Cells,pAPCs）如抗原呈递能力最强的树突状细胞等（dendritic cells,DCs）特异捕获，也使抗原呈递效率不高，另外肿瘤抗原对非专职抗原呈递细胞（non-professional antigen-presenting cells,non-pAPCs）的转染可导致T细胞对该抗原的耐受等。为了解决以上问题，我们尝试研究对肿瘤细胞内基因进行改造，得到含有特殊质粒的肿瘤细胞外泌体并且能够靶向DC细胞以促进细胞成熟及活化，利用DEXs诱导对肿瘤细胞杀伤产生更加强效有力的免疫应答反应，旨在更有效地在体内激发抗HPV感染CTL应答，获得较为理想的免疫效果。　　方法：　　1.利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法扩增目的基因：E7、VTB和GM-CSF。　　2.构建含有E7、VTB和GM-CSF目的基因的质粒PSB1986和PSB1244，经过酶切、重组和转化得到两种重组的慢病毒表达载体PSE2309和PMT143。　　3.将培养好的第三代293T细胞18份随机分为空白对照组，PMT143组和PSE2309组，每组6份。通过慢病毒质粒转染293T细胞，转染24h后经荧光显微镜观察转染效率达到90％以上。　　4.通过荧光定量聚合酶链反应（QPCR）技术检测空白对照组及两种质粒转染293T细胞在mRNA水平上VTB、E7和GM-CSF基因表达量，并对所得结果采用SPSS19．0进行统计学分析。　　5.收集培养两周的细胞培养液，采用差速离心法分离出293T细胞所分泌的外泌体；通过Western Blot（WB）检测其两种质粒转染293T细胞分泌的外泌体中VTB、E7蛋白表达情况。　　结果：　　1.表达载体PSE2309和PMT143分别经阳性克隆测序显示载体序列与目的基因序列一致，表明重组质粒构建成功。　　2.PSE2309组和PMT143组转染293T细胞24h后经荧光显微镜观察转染效率均达到90％以上。经RT-PCR反应293T细胞在mRNA水平上也检测到VTB、E7和GM-CSF目的基因的表达，空白对照组E7、VTB和GM-CSF的2-ΔΔCt值分别为0.625±0.644,0.701±0.015,0.320±0.165；PMT143对照组E7、VTB和GM-CSF的2-ΔΔCt值分别为2.764±3.705，1.000±0.006，1.005±0.106；PSE2309实验组E7、VTB和GM-CSF的2-ΔΔCt值分别为19429392.33±5655622.378，5408295±540235.211，120101.2±1442.509。经统计学分析后，PSE2309实验组E7、VTB和GM-CSF的2-ΔΔCt值明显高于空白对照组和PMT143对照组，差异有显著统计学意义（p<0.01）。　　3.Western blot方法检测到PSE2309转染293T细胞分泌的外泌体中有VTB和E7的表达，表明可利用有独特优越性的外泌体作为抗原载体承载特异抗原构建免疫治疗疫苗。　　结论：　　慢病毒质粒PSE2309转染293T细胞后E7、VTB和GM-CSF基因过表达，明显高于PMT143组，在其细胞分泌的外泌体中也检测到VTB和E7的表达，此为获得一种高免疫原性和高特异结合的抗HPV感染外泌体疫苗奠定基础。