论文部分内容阅读
目的小细胞肺癌是肺癌的特殊类型,其突出特征是早期易出现淋巴及血行转移。虽然小细胞肺癌对放射治疗和化学治疗较敏感,但容易出现耐药和复发,这些都严重威胁着人类的健康和生命。因此筛选新的小细胞肺癌相关基因并探讨其发病及转移机制,寻找潜在的靶向治疗基因对于小细胞肺癌治疗的研究尤显重要。ABCE1基因属ATP结合盒转运子基因亚家族,它的cDNA编码一种分子量为68KD的蛋白,又称核糖核酸酶L抑制因子。ABCE1基因位于细胞浆及线粒体,该基因在人体多种组织和器官普遍表达,但表达水平不同。ABCE1基因能够抑制细胞凋亡过程,并可能在促进蛋白质合成及细胞增殖分化过程中发挥着作用。因此我们构建ABCE1基因的pEGFP正义及SiRNA表达载体,通过将载体转染入小细胞肺癌细胞株NCI-H446,研究ABCE1基因对小细胞肺癌增殖、侵袭、转移能力以及细胞凋亡的影响,同时探讨ABCE1基因在人小细胞肺癌组织、细胞株、转移淋巴结及癌旁肺组织中的表达差异。方法根据小细胞肺癌相关基因ABCE1的序列,设计引物,提取小细胞肺癌细胞株（NCI-H446）的总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。将ABCE1的cDNA插入携带绿色荧光蛋白报告基因的载体pEGFP-C1,形成重组载体pEGFP-ABCE1,扩增后提取重组质粒pEGFP-ABCE1酶切,电泳,DNA测序鉴定。根据ABCE1的DNA序列设计3对SiRNA引物,寡核苷酸退火后插入到携带红色荧光蛋白报告基因pSIREN-DNR载体中,扩增后提取重组质粒ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、ABCE1-SiRNA-N,酶切,电泳,DNA测序鉴定。小细胞肺癌细胞NCI-H446,在含10%胎牛血清的1640完全培养液中,37℃和5%CO2条件下培养。采用FUGENE-HD法将载体pEGFP-ABCE1、ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、pEGFP-C1、ABCE1-SiRNA-N转染入小细胞肺癌细胞中。转染48小时后应用Western blot及免疫组织化学法检测转染后ABCE1蛋白表达。MTT法、Transwell小室、划痕实验以及流式细胞仪检测NCI-H446细胞在转染前后的增殖能力、侵袭能力、迁移能力及细胞凋亡数目的改变。同时应用免疫组织化学法、Western blot方法,检测人小细胞肺癌组织、细胞株、转移淋巴结及癌旁肺组织中ABCE1的表达情况。在上述实验基础上构建可以用于筛选阳性克隆且带有绿色荧光的ABCE1基因SiRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-1、ABCE1-PRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-2及ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-N,采用FUGENE-HD法将载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-1、ABCE1-PRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-2及ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-N转染入NCI-H446细胞中,并以G418（400μg/ml）进行阳性克隆筛选,筛选ABCE1基因沉默的稳定转染细胞系。结果经酶切和DNA测序验证,证实pEGFP-ABCE1、ABCE1-SiRNA及ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA表达载体构建成功。免疫组织化学法、Western blot方法检测发现:小细胞肺癌组织及转移淋巴结中ABCE1的表达水平明显高于癌旁肺组织,差异具有显著性。小细胞肺癌细胞株同样显示ABCE1的高表达。转染ABCE1-SiRNA后的小细胞肺癌细胞内可见红色荧光。在转染ABCE1-SiRNA-N的NCI-H446细胞中,其ABCE1基因呈高表达,而转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2的细胞呈低表达,故确认目的载体ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2已成功转染至NCI-H446细胞中并起到了一定程度的沉默ABCE1基因的目的。MTT实验提示,转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2的小细胞肺癌细胞与转染ABCE1-SiRNA-N的同类细胞相比增殖能力受到明显抑制,转染ABCE1-SiRNA-N后的细胞增殖程度与对照组细胞则无明显改变。Transwell实验发现转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2后的小细胞肺癌细胞穿膜细胞数较未转染的和转染ABCE1-SiRNA-N组细胞明显减少,而转染ABCE1-SiRNA-N后的穿膜细胞数较对照组细胞则无明显增加。划痕实验显示转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2后的小细胞肺癌细胞迁移速度明显慢于转染ABCE1-SiRNA-N的细胞和对照组细胞。流式细胞仪检测显示转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2后凋亡的细胞比转染ABCE1-SiRNA-N和对照组的细胞明显增多。将ABCE1基因SiRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-2、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA-N成功转染小细胞肺癌细胞NCI-H446后,小细胞肺癌细胞内可见绿色荧光,通过G418筛选,获得了ABCE1基因沉默的小细胞肺癌细胞系,该细胞系的ABCE1水平明显低于未转染SiRNA的小细胞肺癌细胞。结论1、成功的构建了ABCE1正义表达载体pEGFP-ABCE1及SiRNA表达载体ABCE1-SiRNA和ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-SiRNA。ABCE1基因在人小细胞肺癌及转移淋巴结中呈高水平表达,而在癌旁肺组织则表达较低,提示ABCE1可能参与了小细胞肺癌的发生及进展过程。小细胞肺癌细胞株同样显示ABCE1的高表达。2、ABCE1基因SiRNA表达载体ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2转染人小细胞肺癌细胞后不仅可抑制ABCE1基因的表达,而且还能明显的抑制细胞生长,使其增殖能力下降,降低其侵袭、迁移能力并诱导细胞凋亡。3、成功构建了ABCE1基因沉默的稳定转染小细胞肺癌细胞系,这将为今后应用ABCE1基因SiRNA表达载体研究ABCE1基因的作用机制提供实验基础。