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背景腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）与乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Co A Carboxylase,ACC）作为其各自代谢调节过程中的关键环节,相互之间存在密切联系,形成细胞内的上游和下游的信号通路。AMPK是机体和细胞能量代谢的调节器,当细胞内ATP水平下降时,细胞处于能量应激状态下,AMPK激活,为细胞提供能量[1]。ACC是存在于胞浆中含有生物素的变构羧化酶,是脂肪酸代谢过程中的限速酶,其使乙酰辅酶A羧化成丙二酰辅酶A。在人类ACC有两种亚型,ACC1和ACC2。近年来发现肿瘤代谢在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药过程中起着重要的作用[2],而AMPK和ACC在肿瘤代谢中发挥着核心作用。在我们的前期研究中发现,一种表皮生长因子受体阻断抗体,西妥昔单抗可以抑制肿瘤代谢并且可以在肿瘤细胞中逆转Warburg效应（肿瘤有氧糖酵解）[3]。我们同样发现AMPK的短暂激活在应用西妥昔单抗治疗肿瘤细胞的早期是一项重要指标,但长期且持续激活的AMPK水平是肿瘤耐药的一种机制[4]。与西妥昔单抗治疗前的头颈鳞癌比较,治疗后组织及细胞高表达磷酸化AMPK、磷酸化ACC及ACC。我们设计本实验,进一步明确ACC在头颈鳞癌组织及细胞中的表达方式;从临床水平、细胞水平及动物实验水平探索ACC在肿瘤代谢过程中功能及其分子调控机制。方法1.应用分子克隆方法构建乏氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）与乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Co A Carboxylase,ACC）过表达质粒,构建慢病毒稳定转染系统,建立稳定过表达HIF-1α的HEK293HIF-1α细胞系;用Western blot,葡萄糖消耗实验（Glucose consumption assay）检测所构建稳系HEK293HIF-1α的表达水平及其对于葡萄糖的消耗水平。2.应用分子克隆方法构建乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Co A Carboxylase,ACC）,ACC1S79A及ACC2S212A过表达质粒,构建慢病毒稳定转染系统,建立稳定过表达的ACC1S79A和ACC2S212A的HEK293HIF-1α细胞系;用Western blot,细胞生存死亡实验（Live/dead cell viability assay）检测AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表达水平,检测在能量应激状况下（低糖）不同稳转细胞的存活率。3.应用Western blot、MTT检测不同头颈鳞癌细胞系代谢相关指标及对西妥昔单抗敏感性。应用RT-RCR检测不同细胞系ACC1和ACC2m RNA水平。应用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）抑制蛋白合成,检测ACC降解水平。4.应用ACC1S79A及ACC2S212A过表达质粒及ACC1、ACC2小干扰RNA（si RNA）转染头颈鳞癌细胞系;用Western blot、细胞生存死亡实验（Live/dead cell viability assay）、细胞增殖实验（Cell proliferation assay）、凋亡实验（Apoptosis assay）检测肿瘤细胞经过西妥昔单抗治疗前后AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表达水平及细胞存活率,细胞凋亡状况。5.应用ACC及脂肪酸合成抑制剂5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸（5-Tetradecyloxy-2-furoic acid,TOFA）抑制ACC,通过Western blot、流式细胞技术、细胞增殖实验（MTT）、凋亡实验（Apoptosis assay）检测TOFA对西妥昔单抗耐药头颈鳞癌细胞系的作用。6.构建裸鼠（Nude Mouse）皮下移植瘤模型,应用TOFA,检测肿瘤的增殖情况,并通过荧光成像（Luciferase image）和免疫组织化学的方法,探讨磷酸化AMPK、磷酸化ACC及ACC的表达与西妥昔单抗治疗的相关性。7.搜集头颈鳞癌组织石蜡标本资料进行回顾性研究,AMPK-T172p,ACC-S79p和ACC的表达表达水平与西妥昔单抗治疗的相关性。结果1.转染HIF-1α使HEK293细胞肿瘤化特征。予以正常胚胎肾细胞HEK293细胞系过表达HIF-1αP402A/P564A和HIF-1α35ODD后,发现转染HIF-1α的HEK293细胞对于葡萄糖的消耗明显增加（由于Warberg效应）,同时伴随AMPK的激活（表现为AMPK T172磷酸化的增加）和ACC的抑制（表现为ACC S79磷酸化的增加）。转染HIF-1α的HEK293细胞对于低糖环境更敏感。2.能量应激（低糖）状况下ACC表现出对细胞重要的保护功能。过表达的ACC1S79A和ACC2S212A对于AMPK的激活没有作用,对于低糖所导致的内源性的ACC的抑制没有作用,这表明ACC可以保护低糖环境中的细胞存活是不由AMPK的激活所介导的。而且,敲除内源性ACC1和ACC2,特别是ACC1导致了在低糖环境下更多的HEK293和HEK293 HIF-1αP402A/P564A细胞的死亡。在HEK293 HIF-1αP402A/P564A细胞中敲除ACC1,16小时后约80%细胞死亡。3.磷酸化AMPK和磷酸化ACC的表达水平与头颈鳞癌细胞对西妥昔单抗的耐药相关。我们的前期研究发现西妥昔单抗可通过下调HIF-1α和抑制HIF-1α调节的糖酵解来激活AMPK并且抑制HNSCC细胞的增殖。进一步发现高表达的磷酸化AMPK T172和磷酸化ACC S79与头颈鳞癌细胞系对西妥昔单抗的敏感性呈负相关。这个结果同样在获得性耐药西妥昔单抗的两对等基因细胞中HN5/HN5-R和Fa Du/Fa Du-R中得到证实。进一步发现稳转HN5HIF-1αP402A/P564A细胞激活AMPK抑制ACC,对西妥昔单抗耐药。4.ACC的表达水平与西妥昔单抗耐药相关。RT-PCR的结果显示增加的ACC不是由于转录水平的增加引起的,经过西妥昔单抗治疗后,HN5细胞中SREBP-1c下降明显,而HN5-R细胞中SREBP-1c无明显变化,相似的结果在另外两种耐药细胞UMSCC1和MDA1986中得到证实。ACC在HN5-R中明显比在HN5中更加稳定,代谢减慢,预示着一种转录后机制是ACC升高的原因。应用si RNA技术在HN5中敲除内源性ACC1和ACC2并没有影响西妥昔单抗治疗后凋亡的水平,而在两种耐药细胞HN5-R和UMSCC1中,可以看到明显的凋亡增加。5.西妥昔单抗耐药细胞对于TOFA更敏感,包括获得性耐药的HN5-R,天然耐药的UMSCC1和MDA1986。而且长期慢性暴露于TOFA治疗的UMSCC1-TOFA耐药细胞逆转为对西妥昔单抗敏感。TOFA与西妥昔单抗和用能明显的引起耐药细胞HN5-R、UMSCC1和MDA1986的凋亡,联合用药效果明显。6.体内动物实验证实联合用药对于西妥昔单抗耐药细胞有明显的效果。我们通过测量肿瘤的大小和IVIS肿瘤成像测量。应用TOFA治疗没有使裸鼠体重下降。免疫组化证实经西妥昔单抗治疗肿瘤组织磷酸化AMPK T172、磷酸化ACC S79和ACC与对照未治疗组增加,联合用药组免疫组化结果与体外细胞实验相符,应用UMSCC1细胞同样得到证实。7.我们收集了18例头颈鳞癌患者,其中6例经过化疗+西妥昔单抗治疗后手术,剩余18例为对照化疗后手术。其中第六例患者为化疗后手术,复发后给予化疗+西妥昔单抗治疗后再次手术。以第六例患者为例,可以明显发现经过西妥昔单抗治疗后,磷酸化AMPK T172、磷酸化ACC S79和ACC全部高表达。结论1.肿瘤处于应激状态下,ACC发挥着不可或缺的双重作用使肿瘤细胞得以存活、生长和增殖。2.ACC在肿瘤细胞由依赖于糖酵解转化为依赖于脂肪酸氧化的肿瘤代谢重新调整过程中发挥重要作用。3.对于西妥昔单抗耐药肿瘤,以抗ACC为靶点,我们可以发现合理的治疗手段,也可能增加其他以抗肿瘤Warberg效应为靶点的治疗效果。