研究背景与目的肾母细胞瘤（Nephroblastoma）,又被称为Wilms瘤,由Max Wilms医生于1899年首先做出了详细的病理学描述,是儿童期泌尿系统最常见的恶性肿瘤,约占儿童泌尿系统恶性肿瘤的90%以上。肾母细胞瘤在15岁及以下儿童的发病率约为7.7/1000000,其中黑人发病率最高,东亚发病率最低。肾母细胞瘤常见于5岁以下儿童,平均发病年龄为38个月,可合并虹膜缺如、发育迟缓、尿道下裂、偏侧肥大等发育畸形。典型的肾母细胞瘤由胚芽、间质、上皮成分构成,在肿瘤细胞检出间变者被称为间变型,依据其组织分型及预后的关系分为预后良好型（Favorable histology,FH）和预后不良型（Unfavorable histology,UH）。目前肾母细胞瘤的治疗方案为包含手术、化疗和放疗的综合治疗。自上世纪70年代末以来,北美儿童肿瘤协作组（Children’s Oncology Group,COG）和欧洲的儿童肿瘤国际协会（International Society of Pediatric Oncology,SIOP）开展了一系列的临床研究,儿童肾母细胞瘤的5年生存率得到显著提高,在发达国家可以超过90%,国内研究报道5年生存率也达到80%以上。但手术治疗联合放化疗往往有严重的副作用,25%的生存患儿后续可能会面临肾衰竭、心脏功能不全,生育力受损等诸多并发症,而且综合治疗对于远处转移及间变型肾母细胞瘤患儿治疗效果有限。因此,进一步探讨肾母细胞瘤的发生及进展机制,对于寻找肾母细胞瘤新的治疗靶点具有重要意义。微小RNA（microRNA,miRNA）为内源性单链非编码RNA,长度为18-25个核苷酸。miRNA可通过与靶mRNA完全或不完全互补配对,降解或抑制靶mRNA的翻译过程,是一种转录后的基因表达调控。miRNA在发育、生长、代谢等许多生物学过程中发挥重要作用,特别是在肿瘤疾病中,miRNA能够调节肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡,例如肾癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、骨肉瘤等。研究显示,miRNA在肾母细胞瘤中存在异常表达,提示miRNA在肾母细胞瘤发生发展过程中可能起到重要作用。目前已有多种miRNA被证实与肾母细胞瘤相关,如Oncomir-1,miR-483-3p/5p,miR-204,miR-185等。利用miRNAs芯片筛选肾母细胞瘤组织、血清或细胞系中表达的miRNA并进行荧光定量PCR验证,是识别差异表达miRNA的常用方法。然而,miRNAs芯片也存在缺少最近注释的miRNA、不能预测新的miRNA以及验证率较低等缺点。小RNA测序（small RNA sequencing,sRNA-Seq）采用Illumina高通量二代测序技术,具有所需样本量少、高通量和高精确性等特点,通过高通量测序,一次测序即可获得数百万条小RNA序列,再经过生物信息学分析软件分析,可以快速鉴定出特定组织或者特定时期下表达的已知小RNA,并预测新的小RNA,同时可以对小RNA的表达、结构以及靶基因等方面进行深入分析。应用小RNA测序技术对肾母细胞瘤的研究可以更深入了解肾母细胞瘤的miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,为肾母细胞瘤的发病机制研究提供新思路。miR-363-3p是近年来新发现的一种微小RNA,众多研究发现,miR-363-3p在多种肿瘤性疾病发挥了抗肿瘤作用,是一种抑癌基因。例如,miRNA-363-3p在胃癌组织和胃癌细胞系中表达下调,过表达miR-363-3p可抑制胃癌细胞的生长和迁移;与瘤旁组织相比,miR-363-3p在膀胱癌组织中表达下调,过表达miR-363-3p可抑制膀胱癌细胞的迁移能力,而过表达其靶基因BTG2后可逆转miR-363-3p对膀胱癌细胞迁移能力的抑制作用;在非小细胞肺癌中,过表达miR-363-3p可抑制肿瘤细胞的增殖,通过抑制上皮-间充质转化抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,提高对吉西他滨化疗的敏感性。然而,miR-363-3p是否在肾母细胞瘤中发挥调控作用尚无相关研究。因此本课题通过高通量测筛选了肾母细胞瘤中差异表达的miRNA,并对其靶基因进行分析,选取miR-363-3p作为研究对象,对miR-363-3p及其靶基因对肾母细胞瘤生物学特性的调控作用进行了探讨。方法收集我院小儿外科收治的肾母细胞瘤患儿的手术切除标本,标本包括肿瘤组织及其配对的瘤旁正常组织,所有患儿术前均未行放化疗,所有标本经病理科两名病理专家诊断为肾母细胞瘤。选取其中3例患儿（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各1例）的肿瘤及配对的瘤旁正常组织进行小RNA测序,检测肿瘤组织及瘤旁正常组织中差异表达的小RNA,在miRanda和TargetScan两个靶基因预测网站中对差异表达的miRNA进行靶基因预测,测得结果取交集后对差异表达显著的miRNA的靶基因做GO富集分析和KEGG Pathway分析,分析其参与的本体学注释及参与的重要信号通路。筛选出差异表达的miR-363-3p,并在其余组织标本中进行RT-qPCR验证。通过慢病毒转染建立稳定上调表达miR-363-3p的SK-NEP-1细胞,RT-qPCR验证转染效率,通过CCK-8实验检测转染后细胞增殖能力,Transwell实验检测转染后细胞迁移能力,AO/EB检测转染细胞死亡的情况。通过生物信息学软件预测miR-363-3p的靶基因,选取肾母细胞瘤过表达基因（Nephroblastoma Overexpressed Gene,NOV）作为靶基因验证。通过双荧光素酶报告基因方法验证miR-363-3p与NOV的靶向调控关系。在SK-NEP-1细胞中转染miR-363-3p慢病毒后,运用Western Blotting检测转染后NOV蛋白表达水平,验证其靶向调控关系。在肾母细胞瘤及瘤旁正常肾组织中通过Western Blotting及免疫组化染色验证NOV的表达情况及其与临床病理分期的关系。慢病毒转染构建稳定低表达NOV的SK-NEP-1细胞株,CCK-8实验检测不同组细胞活力,Transwell实验检测细胞迁移能力,AO/EB检测细胞死亡的情况,Western Blotting检测c-Parp1、Bcl-2,Bax、c-caspase-3 凋亡蛋白的表达。结果一、肾母细胞瘤肿瘤组织及瘤旁组织高通量测序结果分析1.通过高通量测序检测,发现肾母细胞瘤肿瘤组织与瘤旁正常组织中存在234中差异表达的miRNA,其中上调表达107种,下调表达127种。通过GO功能分析发现差异表达的miRNA的靶基因在生物过程中主要富集于细胞进程、生理调节、代谢过程,细胞位置中主要富集于细胞组分、细胞器、细胞膜组成,分子功能主要富集于结合、催化、结构分子活性。通过KEGG富集分析发现差异表达的miRNA的靶基因主要集中于RAS信号通路、昼夜节律、cAMP通路。2.经筛选后,选择miR-363-3p进行下一步验证,在肾母细胞瘤及瘤旁组织中通过RT-qPCR验证证实miR-363-3p在肾母细胞瘤组织中低表达。二、miR-363-3p/NOV对肾母细胞瘤生物学特性的调控研究1.通过miR-363-3p过表达慢病毒转染SK-NEP-1细胞,过表达miR-363-3p后SK-NEP-1细胞通过CCK8实验、Transwell实验及AO/EB荧光双染发现其增殖、迁移能力降低,细胞死亡增加。2.通过双荧光素酶实验验证miR-363-3p和可以靶向结合NOV的3’非编码区（3’ untranslated region,3’ UTR）,NOV 野生型 3’ UTR 区荧光素酶活性被显著抑制（P＜0.05）。转染miR-363-3p过表达慢病毒后,Western Blotting检测发现NOV蛋白表达水平降低,说明miR-363-3p可调控NOV的表达。3.Western Blotting检测NOV蛋白在肾母细胞瘤组织中较正常高表达,免疫组化染色显示NOV蛋白高表达与患儿年龄、性别、分期及病理分型无显著相关性,与淋巴结转移相关密切相关。通过转染NOV shRNA慢病毒,建立稳定下调表达NOV蛋白的SK-NEP-1细胞,经CCK8实验、Transwell实验、AO/EB双染实验及 Western Blotting 检测 c-Parp1、Bax、Bcl-2、c-caspase-3 等凋亡蛋白发现NOV敲低可抑制SK-NEP-1细胞的增殖、迁移能力,促进细胞的凋亡。结论1.高通量测序结果提示肾母细胞瘤肿瘤组织中存在234种异常表达的miRNA,其通过调控靶基因参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。2.miR-363-3p在肾母细胞瘤组织中表达下调,过表达miR-363-3p可以抑制SK-NEP-1细胞的增殖、迁移并促进其死亡。3.miR-363-3p可以靶向结合NOV的3’ UTR,并调控其表达。4.NOV在肾母细胞瘤组织中高表达;下调NOV的表达可以抑制肾母细胞瘤细胞的增殖、迁移并促进其凋亡,起到促癌基因作用