大鼠2/3肝切除是研究器官再生和可控增殖的一种重要模型。外泌体是一种由细胞分泌到胞外微环境的纳米级囊泡,可以被受体细胞吸收,发挥物质传递和信息交流的作用。肝脏的大多数细胞可以分泌外泌体并参与调控肝脏的生理病理过程。因此,探究肝再生期间外泌体的变化和功能有助于我们进一步发掘肝再生的机制和运用于肝癌和肝衰竭的治疗。我们利用EDTA-2Na螯合法结合差速离心法提取了肝切除72h组和假手术组的肝组织外泌体。采用免疫印迹、纳米颗粒示踪分析技术和透射电子显微镜进行了外泌体表征,表明获得的肝组织外泌体样品符合外泌体的一般特征,适用于后续蛋白质组分析。将EDTA-2Na螯合法与胶原酶酶解法和浸润法进行对比,免疫印迹结果显示EDTA-2Na螯合法分离的外泌体样品富集更多的外泌体标志蛋白CD81和CD63,含有更少的内质网污染物蛋白Calnexin,表明EDTA-2Na螯合法提取的大鼠肝组织外泌体纯度更高。将肝切除72h组和假手术组的肝组织外泌体进行了TMT定量差异蛋白质组分析,在三组定量重复实验结果中,一共鉴定到3679个蛋白质,其中3240个蛋白质包含定量信息,差异表达量变化超过1.5倍的蛋白有518个。对差异表达蛋白进行基因功能聚类分析,从细胞组分看,定位在囊泡和胞外外泌体的蛋白所占比例最高,体现了外泌体样品的纯度较高。从生物进程看,富集到大量与代谢相关的过程,包括氧化还原过程和脂质代谢过程等。从分子功能看,占比最高的是催化活性,其次是氧化还原酶活性等。分子功能还富集到大量与结合相关的功能,包括四吡咯结合、铁离子结合等。KEGG信号通路富集分析显示上调蛋白显著富集到与细胞增殖、肝脏代谢功能相关的通路,还富集到铁死亡、胰岛素抵抗、吞噬体、紧密连接等通路。下调蛋白显著富集的通路有类固醇激素生物合成、视黄醇新陈代谢、化学致癌等通路。铁死亡通路和铁离子结合功能在肝切除72h外泌体差异表达蛋白中被显著富集。肝切除72h一系列与铁死亡相关的蛋白质在外泌体中表达量发生变化,包括TFR1、STEAP3、DMT1、ZIP14、Ferritin、PHKG2、TFR2、GPX4等,它们通过增加细胞内铁离子的浓度和降低细胞的抗氧化水平来诱导铁死亡的发生。因此,外泌体介导的铁死亡通路可能在肝再生终止阶段中发挥作用,抑制肝实质细胞过度增殖,从而实现再生肝脏的有序可控的增长。