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弓形虫又名刚地弓形虫(Toxoplasma gondii),是一种机会致病性原虫,可广泛寄生于人和多种动物除红细胞以外的所有有核细胞内。近年来,弓形虫与其他病原混合感染使弓形虫危害加大,严重损害畜牧业经济效益和威胁人类健康。因此,重视对弓形虫免疫学检测方面的研究,对于弓形虫病的诊断防控有着重要意义。ELISA是目前最常用的弓形虫免疫学检测方法,研制稳定可靠的间接ELISA检测试剂盒,必须选用合适的包被抗原。弓形虫致密颗粒蛋白与虫体在细胞内寄生、发育密切,是免疫原性较强的靶标抗原。本实验室对弓形虫致密颗粒蛋白GRA8全基因进行了克隆表达,并进行了 Western blot和ELISA验证,表明GRA8是一种具有很好诊断价值的弓形虫病诊断抗原。但GRA8基因在原核表达质粒中表达水平低,本实验室通过使用相关分子生物学手段切除了 GRA8的信号肽及疏水区,构建了截短型基因sGRA8的原核表达载体,Western blot验证表明sGRA8原核重组表达蛋白具有很好的抗原性。基于本实验室使用sGRA8蛋白建立的鸡弓形虫抗体ELISA检测方法,敏感性高、特异性强,可在鸡感染130时仍检测到弓形虫抗体。本研究将sGRA8-ELISA方法应用于大鼠、猪、牛、羊以及人,进行弓形虫抗体检测的标准化探索和初步应用。实验中ELISA反应条件在参照鸡弓形虫sGRA8-ELISA诊断方法的基础上,重新对一抗和酶标二抗的稀释比例等反应条件进行摸索与优化,最终确定各项试验条件。本实验首先通过BL21-pCold TF-sGRA8原核表达载体对sGRA8蛋白的诱导表达,以及His亲和层析法过柱纯化,获得了可用于弓形虫抗体ELISA检测方法的可溶性包被抗原。再使用人工感染方式对10只清洁级SD大鼠腹腔注射弓形虫Rh株速殖子,另在清洁环境中饲养10只的未作任何感染SD大鼠,于感染后3-109天分11个批次采集这20只大鼠的血清,如上20只大鼠皆经过PCR诊断验证;通过构建完成的sGRA8-ELISA方法对大鼠待测血清进行检测应用,并与购自BioTSZ公司的进口商品化试剂盒进行比较检测,结果显示:两种检测方法均能够在109天内的大鼠弓形虫感染进行一定程度的识别诊断,在感染第3天时sGRA8-ELISA方法与BioTSZ试剂盒检出阳性份数分别为4份和6份;在感染7-75天时sGRA8-ELISA的阳性血清检出率达到75%-100%,而购自BioTSZ公司的商品化试剂盒阳性率最高达到67%;BioTSZ的试剂盒在大鼠感染75天时检出率开始明显下降,在109天时无法检出,而sGRA8-ELISA方法在109天时的阳性血清的检出率仍可达到67%(4/6);合计sGRA8-ELISA方法敏感性为80%(74/92),BioTSZ公司的试剂盒敏感性为51%(47/92),前者比后者敏感性高出29%;两种检测方法在阴性血清的检测结果上并无差异,特异性均为100%(60/60);表明sGRA8-ELISA检测方法明显优于BioTSZ公司试剂盒的检测效果。通过sGRA8蛋白多克隆抗体检测,效价达到1012。通过针对猪、牛、羊弓形虫抗体sGRA8-ELISA实验条件的优化以及重复性验证,显示出sGRA8-ELISA试剂盒检测猪、牛、羊弓形虫抗体效果良好,与南京奥青公司的ELISA试剂盒有着较高的符合率。用本法对来自16家养猪场809份猪血清进行检测,测得总体阳性率为6.43%(52/809);人的阴阳性血清由珠海海泰生物公司的弓形虫抗体ELISA试剂盒检测筛选,经sGRA8-ELISA实验条件优化以及重复性试验,重新检测38份阳性血清和52份阴性血清并测定OD450值,结果显示与海泰公司试剂盒阳性样本符合率达到:84%(32/38)、阴性样本符合率达到:94%(49/52)。综上所述,sGRA8-ELISA方法在对大鼠、猪、牛、羊及人类弓形虫抗体的检测中表现出良好的综合水平,为下一步开发商品化试剂盒打下基础。