前列腺癌（prostate cancer,PCa）是严重威胁中老年男性健康的常见恶性肿瘤之一,2008年前列腺癌发病率居全球男性恶性肿瘤第2位（仅次于肺癌）,占男性全部恶性肿瘤发病例数的14%。在欧美发达国家,其发病率已超过肺癌连续10年居男性恶性肿瘤首位,而死亡率仅次于肺癌居第二位。美国前列腺癌发病率居所有男性恶性肿瘤的第1位,约占所有男性恶性肿瘤发病率的29%。近年来我国前列腺癌发病率呈现持续快速增长趋势,正成为中国男性泌尿生殖系统发病率最高的肿瘤。世界卫生组织分类方案根据前列腺癌患者的血循环雄激素状态,将前列腺癌分成雄激素依赖型和雄激素非依赖型。激素非依赖型前列腺癌包括雄激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer,AIPC）和激素难治性前列腺癌（hormone-refractory prostate cancer,HRPC）。激素非依赖型前列腺癌目前依然是临床治疗的难点。对于前列腺癌的发病原因,目前的观点普遍认为,其癌变的形成和发展与多种癌基因的激活和抑癌基因的失活/缺失密切相关。抑癌基因是一类能抑制肿瘤细胞增殖、浸润或转移的基因,这些基因产物存在于正常细胞中,在生物体内与癌基因的功能相互抵抗,对调节细胞的发育、生长和分化起重要作用。在一定情况下,抑癌基因被抑制或丢失导致抑癌作用减弱甚至消除,从而成为肿瘤发生、发展及影响预后重要因素。蛋白质泛素化是翻译后修饰的一种常见形式,通过修饰底物蛋白使其泛素化降解,从而调节信号反应及处理衰老、过剩等蛋白在细胞内的堆积。依赖泛素的蛋白质降解途径可以选择性地降解细胞内的蛋白质,是一条重要的非溶酶体蛋白降解途径。越来越多的证据表明,泛素-蛋白酶体信号通路调控失常与恶性肿瘤发生密切相关。恶性肿瘤的发生多伴随癌基因或抑癌基因产物的表达异常,肿瘤可以起因于癌基因蛋白或生长促进因子的非正常稳定或肿瘤抑癌基因的不稳定。某些常规通过蛋白酶体降解的癌基因或抑癌基因蛋白,如果在降解过程中发生异常,就会诱导细胞恶变。一些抑癌基因的不稳定如P27已经证实与蛋白泛素化降解系统密切相关。去泛素化作用可以稳定抑癌基因,从而抑制肿瘤的发生。认识到泛素-蛋白酶体途径及去泛素化作用在肿瘤发生发展过程的重要作用,使肿瘤发病机制的研究进入一个新的深度,也为肿瘤的临床防治开拓了新的领域和思路。EAF2（ELL-associated factor 2,ELL 相关因子 2）/U19（Human up-regulated gene 19）是EAF家族第二个被发现的成员,是在老鼠前列腺中发现的可被雄激素诱导表达上调的一个可以和ELL（eleven-nineteen lysine-rich leukemia）结合的蛋白。EAF2是一个潜在的抑癌基因,王洲教授前期研究发现进展期前列腺癌病理标本可检测到EAF2表达下调、等位基因缺失、启动子甲基化以及等位基因纯合性缺失等,在高恶性度前列腺癌标本中可发现多达82.6%的等位基因杂合型缺失及8%的等位基因纯合性缺失。而在前列腺癌细胞系中EAF2基因的表达是下调的,EAF2转染前列腺癌细胞系可诱导肿瘤细胞凋亡。而在前列腺癌移植老鼠模型中过表达EAF2则会抑制移植瘤的生长。EAF2基因敲除小鼠则会发生肺癌、肝癌、B细胞淋巴瘤以及高级别前列腺上皮内瘤（High-grade prostatic intraepithelial neoplasia,PIN）等,这些肿瘤的发生说明在体情况下EAF2具有抑癌基因的活性。EAF2在前列腺癌发生、发展过程中发挥着重要的抑癌基因的作用。那么,EAF2蛋白是否通过泛素-蛋白酶体系统降解?EAF2蛋白上与降解相关的泛素化位点有哪些?EAF2蛋白稳定性受哪些因素调节?EAF2蛋白的稳定性对其在前列腺癌中发挥抑癌基因促凋亡功能有什么影响?在前列腺癌细胞中EAF2的降解及泛素化情况又是什么样的?EAF2与前列腺癌患者的发展及预后有什么关联性?EAF2在前列腺癌临床治疗上有什么意义?很多与EAF2及前列腺癌相关的问题亟待我们解决。本研究着手解决EAF2泛素化降解途径及其与促细胞凋亡功能的关系,以及EAF2泛素化途径对前列腺癌细胞凋亡的影响。根据本实验室前期的相关研究结果,EAF2在受到雄激素诱导后表达水平明显上调,随后蛋白表达水平逐渐下降。结果显示未予R1881诱导的LNCaP细胞无明显EAF2表达,而经过R1881诱导24小时后可见EAF2表达水平明显升高,而随时间延长EAF2的蛋白水平逐步下降,至96小时后EAF2蛋白下降至较低水平。C4-2细胞中存在基础水平的EAF2蛋白表达,而经过R1881诱导24小时后EAF2表达明显增加,随后EAF2蛋白水平逐步降低。以上结果说明EAF2蛋白为受雄激素诱导表达的蛋白,诱导表达高峰后其逐步降解,为不稳定蛋白。LNCaP及C4-2细胞经过R1881诱导24小时后,经CHX及MG132处理18小时,CHX组可见新蛋白合成受抑制后EAF2蛋白基本降解,而同时加入蛋白酶抑制剂MG132组可见EAF2蛋白酶体降解途径受抑制后蛋白水平保持基本稳定。LNCaP细胞经过R1881诱导24小时后,予以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞18小时后,可见EAF2水平较未处理组明显增加,说明EAF2蛋白酶体降解途径受到抑制。而随着MG132浓度逐渐升高,EAF2蛋白水平逐渐升高,说明EAF2蛋白降解受抑制程度逐渐明显,导致蛋白降解过程受抑制程度增加从而导致蛋白降解减少、堆积增加。而C4-2细胞加入CHX抑制新蛋白合成后,随着时间延长内源性EAF2蛋白水平逐渐下降,24小时后EAF2蛋白水平仅为加入CHX前约1/10,48小时后蛋白基本降解。综合以上结果说明EAF2蛋白降解过程是与蛋白酶体降解途径相关的。前面的实验验证了 EAF2蛋白的降解与蛋白酶体系统是密切相关的,可通过细胞内泛素化免疫共沉淀来验证EAF2蛋白是否为可被泛素化蛋白。实验采用HEK 293细胞及前列腺癌C4-2细胞,以及不同的标签的pCMV-myc-EAF2及pEGFP-EAF2质粒来验证EAF2蛋白的泛素化。泛素化Co-IP结果显示,myc-EAF2或GFP-EAF2及Ub质粒在HEK 293细胞中表达,予以MG132处理后Western blot可见明显弥散的泛素化条带。在C4-2细胞MG132处理后myc-tag EAF2亦可见到类似的弥散的泛素化条带。以上结果说明采用不同标签的EAF2质粒均可得到明显的EAF2泛素化条带,说明标签对EAF2蛋白泛素化基本没有影响。而在非前列腺癌细胞HEK 293细胞及前列腺癌C4-2细胞系中,均可检测到EAF2蛋白的泛素化,说明EAF2蛋白泛素化降解方式不仅存在于前列腺癌细胞中,在其他细胞中可能也是通过泛素-蛋白酶体系统降解的。EAF2蛋白序列上共有17个赖氨酸位点,鉴于目前蛋白泛素化位点预测难度较高,尚无法通过泛素化位点预测软件准确预测特定蛋白的泛素化位点。可行的方法是通过传统的单点突变赖氨酸为精氨酸的方法来分析EAF2的泛素化位点。为分析鉴定EAF2蛋白泛素化位点,我们采用Stratagene公司的QuikChangeTM Ⅱ XL Site-Directed Mutagenesis Kit 单点突变试剂盒构建了myc-EAF2质粒各个赖氨酸位点逐个突变为精氨酸的单点突变质粒,共17个单点突变（K-R）质粒。为检验这些EAF2单点突变（K-R）质粒对EAF2蛋白稳定性的影响,将myc-EAF2-WT质粒及各个单点突变质粒转染C4-2细胞24小时,MG132处理细胞18小时后裂解细胞收集蛋白。myc-EAF2-WT经MG132处理18小时,未处理组EAF2蛋白水平较处理组明显下降,而EAF2-K39R、EAF2-K81R、EAF2-K85R、EAF2-K111R 单点突变 EAF2 蛋白,未经 MG132 处理组myc-EAF2蛋白水平与处理组相比却变化不明显。由此说明,这些位点的赖氨酸突变后,EAF2泛素化水平降低从而降低了 EAF2蛋白的降解速度,这些位点与EAF2泛素化具有密切关系。后续构建了 myc-EAF2-K39-85-111R、myc-EAF2-K39-81-111R、及 myc-EAF2-K39-81-85-111R 多点突变质粒。CHX 处理实验显示,myc-EAF2-WT的半衰期在10小时左右,而单点突变myc-EAF2-K81R蛋白半衰期明显延长达到20小时左右。而三点突变myc-EAF2-K39-85-1 11R半衰期较WT明显延长,但降解速度基本与K81R相近,说明这3个位点（K39-85-111R）泛素化对EAF2蛋白降解的影响与K81R单点突变对EAF2降解的影响相近。4点突变蛋白K39-81-85-111R EAF2较K81R、及K39-85-111R明显延长,达到30小时左右。由此可见,在该4个泛素化突变位点中,K81R对EAF2蛋白的半衰期影响最大,为EAF2蛋白的相对优势泛素化位点。细胞内的泛素化免疫共沉淀进一步验证了这些突变体蛋白的泛素化水平的变化。第39位、第81位、第85位及第111位赖氨酸单独突变后,EAF2的泛素化程度与EAF2-WT相比均有不同程度降低。单点突变K81R泛素化程度较WT 明显降低,而多点突变质粒 myc-EAF2-K39-81-111R 及myc-EAF2-K39-81-85-111R仅可检测到极少量EAF2泛素化蛋白,说明多点突变后EAF2的泛素化基本受到抑制。美国加州大学伯克利分校Dr.Zhou Qiang教授实验室已鉴定出SEC复合物中ELL2的E3连接酶为siah家族成员siah1。Siah家族由同源异构体siah1及siah2组成。因此,鉴于EAF2在该复合物的重要性,我们推测siah1或siah2可能也与EAF2的降解密切相关。结果显示当EAF2分别与siah1或siah2共表达后,可见EAF2与siah2共表达时蛋白水平明显下降。这说明当siah2存在时,EAF2蛋白稳定性进一步下降。在EAF2与siah2共表达24小时后,加入蛋白酶体抑制剂MG132处理后EAF2蛋白水平明显升高,说明MG132可阻断siah2对EAF2蛋白降解过程的作用。进一步通过免疫共沉淀来验证siah2是否与EAF2存在相互作用,为后续验证siah2为EAF2的E3连接酶提供进一步的证据。IP结果显示当HA-siah1或者HA-siah2与EAF2共表达时,仅有HA-siah2可以拉下EAF2蛋白,HA-siah1未见明显EAF2阳性蛋白条带,说明siah2与EAF2有相互作用,而siah1与EAF2无明确直接相互作用。为进一步确定siah2是否与EAF2的泛素化过程相关,采用泛素化免疫共沉淀观察siah2与EAF2共表达时EAF2泛素化程度的改变。结果显示,采取短曝光时间可见MG132处理组的siah1及siah2均可增强EAF2泛素化水平,其中siah2作用明显强于siah1。长曝光时间可见MG132未处理组的siah1及siah2均可增强EAF2泛素化水平,其中siah2作用明显强于siah1,说明即使不存在MG132的积聚作用,siah2与EAF2共表达后仍可明显增强EAF2的泛素化水平。另Co-IP结果显示,仅有HA-siah2蛋白可以被GFP-EAF2蛋白拉下,而HA-siah1未见明显阳性条带。这个结果从另一个方面说明,EAF2和siah2存在直接相互作用。这些结果说明,siah2可以增加EAF2的泛素化水平,且siah2与EAF2存在直接相互作用。我们需要进一步的实验结果如体外泛素化实验来验证siah2是否为EAF2的E3连接酶。转录延长复合物（SEC）由ELL1/2/3、EAF1/2等蛋白组成,在RNA转录复制过程中起了重要作用。而EAF2作为SEC复合物中重要的一个分子,其蛋白稳定性对于SEC复合物具有重要意义。以往的研究结果显示ELL1可以稳定EAF2蛋白,那么ELL2对EAF2蛋白有稳定作用吗?ELL1通过什么机制稳定EAF2蛋白?分别将ELL1或ELL2与EAF2共表达24小时后,予以MG132处理18小时,结果可见EAF2单独表达时,EAF2在18小时内基本降解,而当EAF2与ELL1共表达时,EAF2的稳定性明显增加,MG132处理组与未处理组的蛋白稳定性无明显差异,说明当ELL1存在时,EAF2的蛋白稳定性明显增加。而当ELL2与EAF2共表达时,EAF2的蛋白稳定性则未见明显改变。从以上的实验结果可知,ELL1与EAF2共表达后EAF2的稳定性明显增加,说明两者结合后EAF2蛋白的降解途径受到抑制,那么是否由于两者结合后EAF2的泛素化位点被ELL1蛋白封闭从而阻断了 EAF2的泛素化降解途径呢?结果显示当ELL1与EAF2共表达与EAF2单独表达时相比,MG132处理组EAF2的泛素化程度几乎与阴性对照相近,说明当ELL1与EAF2结合后,EAF2泛素化位点受到封闭使EAF2几乎无法进行泛素化修饰,导致EAF2蛋白泛素化降解途径受到阻断。而ELL2与EAF2蛋白的结合则不影响EAF2的泛素化,从而不影响EAF2的泛素化降解途径。已知ELL1与EAF2蛋白的结合区域位于EAF2的1-113位氨基酸序列上。结合上述实验结果,本研究所鉴定的EAF2泛素化位点为第39、81、85、111位赖氨酸,均位于EAF2蛋白的ELL1结合区域内,当ELL1与EAF2蛋白结合后,这几个泛素化位点均可被ELL1蛋白所覆盖,导致EAF2无法进行进一步的泛素化过程。该结果与前述EAF2蛋白泛素化位点筛选实验结果相吻合并相互验证。ELL1与EAF2结合后EAF2上述泛素化位点均可被ELL1覆盖,导致EAF2泛素化进程受阻,从而保证了转录延长复合物（SEC）中EAF2蛋白的稳定性,对SEC复合物保持其稳定的生物功能具有重要的意义。因此,EAF2可能是除ELL2外调节SEC复合物生物功能另一关键蛋白。那么EAF2的泛素化位点突变是否对其与ELL1的结合能力有影响?免疫共沉淀结果显示,将GFP-ELL1与myc-EAF2-WT 或者多点突变 myc-EAF2-K39-81-85-111R 质粒共表达,GFP-ELL1可以拉下与ELL1结合的EAF2或者EAF2突变蛋白,提示EAF2的泛素化位点突变对ELL1与EAF2的蛋白间结合影响并不大。据文献报道,某些蛋白特定泛素化位点的泛素化可能与其胞质-胞核穿梭机制有关。因此,我们采用荧光定位技术来检测EAF2这些泛素化位点突变是否影响EAF2在前列腺癌细胞内的定位。结果显示,GFP-EAF2-WT、GFP-EAF2-K39R、GFP-EAF2-K81R、GFP-EAF2-K85R在C4-2细胞中均是均匀分布的,而GFP-EAF2-K111R则全部集中与细胞核内,这说明K111R位点突变影响了 EAF2的细胞内穿梭功能导致其全部聚集于胞核内。那么EAF2的泛素化状态是否影响EAF2与ELL1的结合呢?根据我们实验室以前的研究结果,同时过表达EAF2与ELL1于C4-2细胞内,可以观察到两者结合在一起形成明显的荧光颗粒,这表明EAF2和ELL1蛋白可在细胞核内形成相应的复合物发挥其生物功能。那么,通过观察 GFP-EAF2-WT 或 EAF2-K39-81-85-111R 多点突变质粒与 RFP-ELL1质粒在前列腺癌C4-2内的荧光表达及定位情况,可以分析EAF2泛素化位点突变是否影响EAF2与ELL1的结合后的核定位。结果显示GFP-EAF2-WT或EAF2-K39-81-85-111R突变型蛋白与RFP-ELL1所形成的颗粒状物质均聚集于核内,EAF2泛素化位点突变没有改变EAF2/ELL1复合物的核定位,荧光颗粒数量亦没有明显差异。EAF2是不稳定蛋白且主要通过泛素化系统降解,因此,泛素化系统对EAF2发挥其生物功能具有重要影响。那么,EAF2作为一个抑癌基因,泛素化系统对EAF2的促凋亡作用有何影响?前面的实验确定K81R对EAF2蛋白半衰期具有较大影响,为避免多个泛素化位点功能不明带来的相互影响,我们采用第81位点（K81R）来检测泛素化位点突变后EAF2蛋白对细胞凋亡功能的影响。该实验选择通用的细胞凋亡指标PARP和caspase3作为评价细胞凋亡的标记物。GFP-EAF2-WT 及 GFP-EAF2-K81R 质粒转染 HEK 293 及 C4-2 细胞 72 小时后,EAF2-K81R转染细胞与GFP-Vector及GFP-EAF2-WT相比,PARP总蛋白明显下调,而cl-caspase 3表达明显上调,尤以在HEK293细胞中的变化明显。这说明突变型EAF2-K81R蛋白稳定性增加后,其促细胞凋亡作用较EAF2-WT明显增强。后续观察细胞转染突变型EAF2后细胞内凋亡基因Bcl-2、Bax以及Survivin变化情况。Bcl-2蛋白的生理功能主要是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命而不影响细胞周期和分化,而Bax具有促凋亡功能。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。结果显示GFP-EAF2-WT及GFP-EAF2-K81R质粒转染HEK 293细胞72小时后,EAF2-K81R转染细胞与GFP-Vector及GFP-EAF2-WT相比,抑制凋亡基因Bcl-2及Survivin均明显下调,而促凋亡基因Bax则明显上调。说明转染EAF2及EAF2-K81R后,细胞开始出现凋亡,EAF2-K81R组较EAF2-WT明显。该结果从另一个方面说明EAF2泛素化位点K81R突变后,EAF2的促细胞凋亡功能进一步增强。综上所述,本研究验证了雄激素诱导蛋白EAF2为不稳定蛋白,EAF2是通过泛素-蛋白酶体系统降解的。随后通过赖氨酸突变法筛选出了 EAF2蛋白第39、81、85及111位赖氨酸为与其蛋白稳定性相关的泛素化位点,并发现第81位赖氨酸是其相对优势泛素化位点。并发现111位赖氨酸的泛素化与EAF2的核内定位相关,而EAF2的泛素化位点突变并不影响其与ELL1的结合及两者结合后的核定位。并发现siah2与EAF2的蛋白稳定性密切相关,siah2与EAF2蛋白存在相互作用,两者共表达时可明显加快EAF2的降解速度。泛素化IP显示siah2可明显增强EAF2的泛素化程度。而ELL1可以通过结合EAF2的泛素化位点从而阻断EAF2的泛素化过程,从而阻断EAF2的泛素化降解途径来稳定EAF2蛋白。泛素化位点突变的EAF2蛋白,其促细胞凋亡作用明显增加,转染K81R后PARP总蛋白明显下调,而cl-caspase 3表达明显上调,抑制凋亡基因Bcl-2及Survivin均明显下调,而促凋亡基因Bax则明显上调。该研究进一步证实了 EAF2的抑癌基因的功能,并发现了其抑癌基因的作用在泛素化位点突变后其促进细胞凋亡的作用明显加强,为后续将EAF2作为前列腺癌等肿瘤提供一个潜在的治疗靶点。