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背景颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,IA)破裂后病死率大约40%。国内有关颅内未破裂动脉瘤流行病学的研究,发现我国动脉瘤患病率约为7%,高于欧美其他国家的患病率。其病因迄今尚未十分清楚,目前多认为IA是一种在先天遗传因素和多种后天环境因素共同作用下发生的复杂性疾病。目的通过本课题研究,探寻出颅内动脉瘤人群的易感基因及其变异特点。在IA的遗传学研究方面提供更准确和全面的基因组信息,在临床方面为IA的诊断和筛选提供分子标记物,为IA的防治提供新的靶点,为提高IA诊断和治疗水平奠定基础。内容(1)确定研究对象并收集样本,同时利用全基因组测序技术进行测序。在本单位和合作单位中,通过临床先证者寻找到10个FIA家系,收集家系患者的外周血液样本;临床收集散发颅内动脉瘤患者290例外周血液样本和257例健康对照组的外周血液样本,提取DNA。我们将对收集到的10例FIA血液样本DNA进行全基因组测序(WGS)测序工作;对收集到的10例FIA血液样本DNA进行全基因组外显子测序(WES)测序工作。(2)依据全基因组测序结果,通过生物信息学分析发现可疑易感基因。本课题将通过对家族性颅内动脉瘤进行全基因组测序和全基因组外显子测序及序列比对,找到单核苷酸多态性位点(SNP),结构变异位点(SV,Structure Variation)、插入缺失位点(In Del,Insertion/Deletion)、拷贝数变异(CNV,Copy number variations)等变异信息。通过生物信息学注释和分析,从中初步筛选出与IA相关的易感基因。(3)借助分子生物学技术、Sanger测序技术等验证相关遗传变异、检测易感基因在散发动脉瘤中的表达。针对通过全基因组测序发现的SNP、SV、CNV、In Del等多种遗传变异,在散发颅内动脉瘤患者290例外周血液样本和257例健康对照组的外周血液样本DNA中,采用不同方法对不同的变异类型进行验证。(4)借助体外实验验证IA相关遗传变异在血管形成中的作用。体外实验利用人脐静脉内皮细胞系,该细胞系具有干细胞的潜能,体外在内皮细胞生长因子的作用下可以迅速增殖传代,我们通过基因敲除技术敲除IA相关变异位点,探讨在血管形成和细胞迁移方面易感基因的功能。方法(1)获得FIA患者DNA样本、散发患者DNA样本以及对照组样本。通过调查问卷发现FIA家系,签订知情同意书,采集FIA患者以及家系成员血液样本,提取DNA。在临床散发患者知情同意后,留取患者血液样本,提取DNA;对照组DNA取自健康志愿者。所有样本获取以后迅速放置于-80℃冰箱中储存。(2)对FIA患者进行WGS测序和数据分析。20例FIA样本行WGS和WES测序。所获得数据进行生物信息学分析,同时与千人基因组数据库以及外显子组集合联合数据库进行比对,在欧洲和日本人群进一步验证。(3)对WGS测序所得结果在散发动脉瘤患者上进行验证。首先对WGS和WES所得结果进行直接验证。(1)SNPs可采用SNP分型检测的方法验证。(2)CNVs可通过Real-time PCR对存在拷贝数变异的片段进行扩增,并根据CT值估算不同个体的拷贝数变化倍数。(3)通过PCR扩增和测序辨别小的SVs,通过亚显微方法发现大的SVs。(4)通过PCR扩增,利用Sanger法测序对小片段的In Del进行验证。(4)基因干涉体外细胞管腔形成实验进行验证。利用基因沉默技术,降低筛选出的IA相关易感基因在血管内皮的表达,通过体外细胞管腔形成实验,在细胞水平观察血管生成的过程,从而观察IA易感基因在人血管形成机制中的作用,如内皮细胞增殖、迁移、形成毛细血管网状结构的情况等。结果(1)本课题最后总共纳入10个家族性颅内动脉瘤家系中的20名FIA患者进行WGS和WES测序,发现IA相关新易感基因ARHGEF17。(2)在散发颅内动脉瘤患者290例外周血液样本和257例健康对照组的外周血液样本DNA中验证新易感基因ARHGEF17的5个变异位点存在差异,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)细胞实验表明易感基因ARHGEF17可以促进血管形成和内皮细胞增殖。结论基因ARHGEF17在颅内动脉瘤形成中具有重要作用,是颅内动脉瘤新易感基因。