研究背景WNT/β-catenin信号通路在人类器官和肿瘤发生中发挥关键效应。WNTs是一组能够编码分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白,其作为信号分子用于调节不同阶段的胚胎发育并参与维持组织稳态。WNT信号的畸变或异常将导致多种人类疾病,如白血病,先天性四肢切断症,精神分裂症,肾损伤,骨发病率,肺纤维化和不同种类的癌症。依据是否涉及β-catenin,WNT信号通路可分为典型(WNT/β-catenin途径)和非典型途径(WNT/平面细胞极性(PCP)或WNT/Ca2+途径)。目前,最广泛研究的WNT途径是典型WNT/β-catenin途径,其在癌症起始和进展中发挥的作用。在WNT/β-catenin途径中,WNT配体可以结合卷曲蛋白(frizzled,Frz)受体激活蓬乱蛋白(DSH),β-catenin磷酸化被抑制,导致细胞内β-catenin积累和核易位,随后β-catenin作为转录共激活因子与T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF1)转录因子复合,并激活下游靶基因使之过表达,如CyclinD1,c-MYC,PLA2G2A等。TCF/LEF家族是一组通过高迁移率基团结合DNA的转录因子。WNT/β-catenin信号通路激活后,其核心参与者β-catenin从细胞质转移到细胞核,并结合到TCF/LEF家族的成员,可以将共激活因子β-catenin募集到它们所靶向基因的增强子元件中,LEF1和TCF是WNT/β-catenin信号通路的转录中枢调节剂。到目前为止,接近50%的人类已知肿瘤显示都与WNT/β-catenin信号传导通路的调节异常有关。甲状腺癌(TC)是最常见的内分泌器官的恶性肿瘤,大多数国家的死亡率为男性0.2～0.4/100,000,女性0.2～0.6/100,000。乳头状甲状腺癌(PTC)是TC最常见的肿瘤亚型,至少占TC的70～80%。由于诊断技术的提高,大多数国家在过去几十年中TC(主要是PTC)的发病率呈上升势头。2014年,在美国大约有63000例新发的TC被确诊。从1975年到2009年,每年的TC发病率从每100,000人4.9增加到每100,000人14.3,PTC的发病率从每100,000人3.4增加到每100,000人12.5。因此PTC发病率的迅速增加在这一变化中发挥重要的推动作用。到2019年,研究预测PTC发病率将增加一倍。这既会给身体健康带来严重影响,又会给家庭、社会和国家带来了庞大的经济负担。胃癌(GC)是一种常见的恶性肿瘤,大约占全球侵袭性肿瘤的10%。在中国,GC的致死率占癌症死亡原因的第二位。尽管有报告提出进展期胃癌(AGC)的5年总体生存率在15%～52%之间而早期胃癌(EGC)的5年总体生存率在88%～97%之间,早期发现、检测和治疗可以显著降低死亡率。目前,大范围的人口变化和环境污染日益加重伴随GC确诊病例和死亡的数量大量增加。研究已证实GC发病率与环境污染呈正相关性。研究方法与结果本文旨在研究WNT/β-catenin信号通路在PTC和GC发生中的作用,主要包括以下研究内容:1.WNT/β-catenin信号通路在PTC发生中的作用。1.1运用人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V2.0来比较5组PTC组织和邻近正常组织。研究方法:为了研究和探索参与PTC发生的分子机制,运用人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V2.0来比较5组PTC组织与邻近正常组织,筛选出1.5倍上调或下调基因表达。运用QRT-PCR和Western blot进一步验证WNT10A,CCND1,RXRG,LEF1,MYC,CTNNB1,TPM3 在 PTC 与邻近正常组织的mRNA和蛋白水平的表达差异。研究结果:使用DAVID分析,六个基因(CCND1,RXRG,LEF1,MYC,CTNNB1,TPM3,WNT10A)被发现上调超过 1.5 倍在 PTC 中。WNT10A 是 WNT配体中唯一表达上调超过1.5倍并其表达上调超出4倍。QRT-PCR和Western blot分别验证 WNT10A,CCND1,RXRG,LEF1,MYC,CTNNB1,TPM3 在 PTC 组织中表达上调,与DNA微阵列芯片结果完全吻合。WNT10A/β-catenin信号通路在PTC中被激活。1.2 WNT10A/β-catenin信号通路的激活对PTC细胞增殖的影响。研究方法:给予PTC细胞(K1)不用浓度WNT10A过表达质粒,通过CCK8细胞增殖实验检测不用浓度WNT10A过表达质粒与细胞增殖能力之间是否存在剂量效应;随后给予K1细胞WNT10A过表达质粒、干扰RNAWNT10A、LEF1过表达质粒、干扰RNALEF1转染,通过CCK8细胞增殖实验、QRT-PCR和Western blot检测并明确WNT10A/β-catenin信号通路对K1细胞增殖的影响。研究结果:CCK8实验结果回示WNT10A/β-catenin信号通路对K1细胞增殖作用随WNT10A质粒浓度增加而增强,存在剂量效应依赖。随后实验过程中,分别给予K1细胞WNT10A过表达质粒、WNT10A过表达质粒+干扰RNALEF1、LEF1过表达质粒、LEF1过表达质粒+干扰RNAWNT10A转染,CCK8结果显示:WNT10A过表达质粒与LEF1过表达质粒对K1细胞增殖能力有显著增强效应,干扰RNALEF1与干扰RNAWNT10A加入后其增殖能力下降。其次QRT-PCR和Western blot结果显示:WNT10A过表达质粒与LEF1过表达质粒作用于 K1 细胞时,WNT10A,CCND1,LEF1,MYC,CTNNB1 在 mRNA 与蛋白水平表达明显上调;加入干扰RNALEF1与干扰RNAWNT10A作用于K1细胞时,WNT10A,CCND1,LEF1,MYC,CTNNB1在mRNA与蛋白水平表达明显下降。1.3 WNT10A/β-catenin信号通路的激活对PTC细胞晚期凋亡的影响。研究方法:通过流式细胞仪分别测定K1细胞周期与细胞凋亡,K1细胞分别给予WNT10A过表达质粒、WNT10A过表达质粒+干扰RNALEF1、LEF1过表达质粒、LEF1过表达质粒+干扰RNAWNT10A转染。研究结果:细胞凋亡与WNT10A和LEF1有密切相关性。结果表明WNT10A过表达质粒与LEF1过表达质粒分别转染于K1细胞都会引起晚期凋亡细胞的比例下降;干扰RNALEF1和干扰RNAWNT10A转染于K1细胞则引起晚期凋亡细胞比例升高。细胞周期检测结果回示:干扰RNAWNT10A转染K1细胞后导致大量细胞静息于细胞周期S期。1.4激活WNT10A/β-catenin信号通路对PTC细胞迁移能力的影响。研究方法:通过伤口愈合实验分别监测给予WNT10A过表达质粒、WNT10A过表达质粒+干扰RNALEF1、LEF1过表达质粒、LEF1过表达质粒+干扰RNAWNT10A转染后K1细胞的迁移能力如何变化。研究结果:在Oh～72h之内,WNT10A过表达质粒与LEF1过表达质粒增强K1细胞迁移能力,加入干扰RNA抑制K1细胞迁移能力。2.WNT/β-catenin信号通路在PFDA诱导胃癌细胞增殖中的作用2.1运用DNA微阵列芯片比较PFDA实验组人胃癌AGS细胞与对照DMSO组人胃癌AGS细胞的差异。研究方法:为研究PFDA调节胃癌细胞增殖的新的分子机制,运用DNA微阵列芯片比较PFDA处理后人胃癌AGS细胞与对照DMSO处理后人胃癌AGS细胞。利用QRT-PCR和Western blot验证PFDA处理组与DMSO对照组在mRNA与蛋白水平表达的差别,是否与DNA微阵列芯片结果一致。研究结果:在DAVID分析中,sPLA2-ⅡA(PLA2G2A)其表达是对照中的21.4%,并且在所有分析基因排第三个改变;sPLA2-ⅡA上游转录因子TCF4是第二个改变最多的基因,在PFDA实验组其表达降低至对照的19.9%。进一步,利用QRT-PCR和Western blot证实DNA微阵列芯片分析结果。同时在Bel-7402细胞中得到进一步的验证,PFDA处理组Bel-7402细胞与对照DMSO组Bel-7402相比,TCF4与PLA2G2A的表达大幅度的降低。以上提示WNT/β-catenin信号通路在其中发挥重要作用。2.2 PFDA对胃癌细胞(AGS)增殖能力的影响。研究方法:通过CCK8和平板克隆形成实验检测PFDA对AGS细胞的影响,分析不同浓度PFDA对AGS细胞的影响和不同全氟化合物对AGS细胞的效应。研究结果:CCK8实验发现,与DMSO对照细胞相比,用一定浓度的PFDA孵育细胞可以显着增加细胞数量。此外,AGS细胞的增殖速度根据PFDA浓度不同而不同,这种剂量依赖性效应由肝细胞系Bel-7402得到验证。平板克隆形成实验进一步验证,与对照组细胞对比,PFDA可以增强细胞集落形成能力超过70%,显著高于在相同浓度下其他全氟化合物(PFOS和PFOA)。2.3 PFDA通过抑制衰老促进AGS细胞增殖。研究方法:为了探索参与PFDA诱导细胞增殖的细胞过程,利用流式细胞术,Western blot和SA-β-gal染色来确定PFDA调节细胞增殖是通过凋亡、自噬还是衰老。研究结果:流式细胞术显示PFDA处理组和DMSO对照组凋亡细胞百分比无显著差异;Western blot结果回示与自噬相关的p62或LC3(LC3-Ⅱ)亦无显著差异。综合分析上述实验结果发现细胞凋亡和自噬都不是PFDA诱导细胞增殖的关键因素。SA-β-gal染色实验结果显示在PFDA处理组中与细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性明显下降即SA-β-gal染色的细胞数目减少和染色强度减弱。归纳上述试验结果证明细胞衰老在PFDA诱导AGS增殖的过程中发挥重要和关键作用。2.4 TCF4和sPLA2-ⅡA对PFDA处理组胃癌细胞的增殖影响。研究方法:探讨WNT/β-catenin信号通路的激活对细胞增殖的影响,利用CCK8,Western blot 和 QRT-PCR 来确定 WNT/β-catenin 信号通路中的 TCF4和sPLA2-ⅡA在PFDA处理组中是如何发挥促进AGS细胞增殖的作用。研究结果:AGS细胞给以TCF4过表达质粒和PLA2G2A过表达质粒处理后,CCK8结果评价AGS增殖能力的变化。转染TCF4过表达质粒和PLA2G2A过表达质粒后,细胞的生长速率分别降低了 60%和30%;然而,在TCF4过表达质粒中加入干扰RNAPLA2G2A,细胞的增殖速率将会显著提高,明显高于仅转染TCF4过表达质粒的增殖速率。Western blot和QRT-PCR结果回示:转染TCF4过表达质粒和PLA2G2A过表达质粒后,细胞恢复TCF4和sPLA2-ⅡA表达,PLA2G2A的表达与TCF4过表达质粒和PLA2G2A过表达质粒的转染剂量呈正相关性。然而,PLA2G2A过表达质粒的转染剂量并不能影响TCF4表达。概括上述结果:WNT/β-catenin信号通路中的转录因子TCF4及其下游的sPLA2-ⅡA可以调节PFDA促AGS细胞增殖的效应。2.5 sPLA2-ⅡA的表达可恢复细胞衰老并发挥抑制AGS细胞增殖的作用.研究方法:用SA-β-gal染色来检测TCF4过表达质粒、PLA2G2A过表达质粒和干扰RNAPLA2G2A转染AGS细胞后对细胞衰老的影响。研究结果:用TCF4过表达质粒和PLA2G2A过表达质粒分别处理AGS细胞后,PLA2G2A的表达都获得恢复,衰老的细胞数量明显增多和细胞染色强度增强;加入干扰RNAPLA2G2A转染后衰老细胞数量显著减少和细胞染色强度也削弱。PFDA通过直接影响sPLA2-ⅡA的表达来诱导细胞衰老抑制,达到刺激细胞增殖的效应。有趣的是,在实验过程中我们发现PFDA处理AGS可显著刺激IL-1 β和IL18分泌,IL-1β和IL-18诱导与NLRP3炎症小体的激活有相关性。PFDA不仅可以通过WNT/β-catenin信号通路促进AGS细胞增殖,还可以刺激AGS细胞中的NLRP3炎症小体聚集。结论第一部分:WNT/β-catenin信号通路在PTC发生中的作用。●人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片分析PTC和相邻正常组织发现,WNT10A/β-catenin信号通路在PTC发生过程中被激活。●参与 WNT10A/β-catenin 信号通路 CCND1,RXRG,LEF1,MYC,CTNNB1,TPM3,WNT10A在PTC组织中表达呈上调状态。● WNT10A/β-catenin信号通路的激活可促进PTC细胞增殖。● WNT10A/β-catenin信号通路的激活抑制PTC细胞晚期凋亡并发挥干扰细胞周期的效应。●激活WNT10A/β-catenin信号通路可增强PTC细胞的迁移能力。第二部分:WNT/β-catenin信号通路在PFDA诱导胃癌细胞增殖中的作用● WNT/β-catenin 信号通路中的 sPLA2-ⅡA 和 TCF4 在 PFDA 处理组 AGS细胞与DMSO对照组AGS细胞中表达有显著差异。● PFDA促进胃癌AGS细胞增殖。● PFDA通过抑制细胞衰老施展促进胃癌AGS细胞增殖的作用。● WNT/β-catenin信号通路中的转录因子TCF4及其下游的sPLA2-ⅡA可以调节PFDA促AGS细胞增殖的效应。● sPLA2-ⅡA的表达可恢复胃癌细胞衰老并抑制胃癌细胞增殖。意义1.WNT/β-catenin信号通路在PTC发生及发展中发挥重要作用,WNT10A有可能为PTC临床治疗提供新靶点和新思路。2.PFDA通过WNT/β-catenin信号通路中的sPLA2-ⅡA和TCF4可促进AGS细胞的增殖,还可以刺激AGS细胞中的NLRP3炎症小体聚集,提示环境污染与癌症和炎症的相关性。