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背景和目的：前列腺癌是老年男性最常见的恶性肿瘤之一,在欧美国家,由前列腺癌导致的死亡人数占恶性肿瘤引起死亡人数的第二位,而我国前列腺癌发病率近年来也呈显著增长趋势。对于早期局限性前列腺癌,根治性前列腺切除术和放疗是较为有效的治疗方法,但对于前列腺癌复发、转移以及进展为激素难治性前列腺癌患者,治疗效果不理想。因此,探寻新的有效治疗方法尤其是晚期前列腺癌是非常必要的。报道指出以树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗为基础的系统性免疫治疗可诱导强大的抗肿瘤效应,这为肿瘤免疫治疗带来了希望。肿瘤免疫效应就是要针对肿瘤相关抗原产生特异性的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL),继以清除肿瘤细胞。PSMA在前列腺癌细胞膜表面高表达,作为理想的肿瘤相关抗原靶位被用作前列腺癌的各种治疗,包括免疫佐剂、免疫治疗及前体药物等。肿瘤免疫应答中,T细胞激活后产生CTL除了需要DCs与T细胞之间TCR:MHC:Ag复合物提供的第一活化信号外,还需要一些共刺激分子对提供的第二刺激信号,上调这些共刺激分子可以促进和增强T细胞免疫应答。肿瘤坏死因子配体(tumor necrosis factor, TNF ligand)和肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor, TNFR)超家族成员,比如4-1BBL/4-1BB,被发现对T细胞的活化影响深远,包括CD4+和CD8+T细胞的活化、扩增、增强T细胞生存期以及抗激活诱导的凋亡。利用抗4-1BB的单克隆抗体或者表达4-1BBL的肿瘤细胞疫苗在动物模型上能打破耐受,诱导肿瘤杀伤性免疫反应。因此,本研究利用重组腺病毒载体,将人PSMA胞外区基因(tPSMA)和鼠4-1BBL基因体外转导DCs,观察DCs疫苗诱导前列腺癌特异性细胞T效应,探寻有效的前列腺癌免疫治疗方法。方法：首先,本研究利用AdMaxTM泉病毒表达系统分别构建共表达tPSMA和m4-1BBL的重组腺病毒(Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL)和携带增强绿色荧光蛋白eGFP的对照腺病毒(Ad-eGFP)。以pcDNA3-m4-1BBL为模板,PCR扩增出4-1BBL全长基因,并克隆到穿梭载体pDC316-VP3-IRES-sEndo-HIS中。以pCR3.1(?)-Uni-hPSMA为模板,PCR扩增人前列腺特异性膜抗原胞外区基因(tPSMA),并克隆到载体PDC316-IRES-EGFP中。随后将包含tPSMA基因的片段从重组质粒pDC316-tPSMA-IRES-EGFP酶切下来,亚克隆到pDC316-VP3-IRES-m4-1BBL中,命名为pDC316-tPSMA-IRES-m4-BBL。经基因测序正确后,用LipofectamineTM2000将重组质粒和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染到293细胞,在细胞内完成同源重组、’包装和扩增。通过荧光显微镜观察eGFP的表达,RT-PCR和western blot检测tPSMA和m4-1BBL的表达。然后,将重组腺病毒Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL和Ad-eGFP感染DCs,制备DCs疫苗。取6-8周龄雄性C57BL/6小鼠的胫骨和股骨骨髓细胞,利用含有重组细胞因子GM-CSF和IL-4的RPMI1640完全培养基体外诱导DCs。培养第7d,收集悬浮的细胞作为未成熟的DCs,用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理24h后,收获成熟DCs。电镜观察细胞的形态学特征来鉴定DCs,流式细胞术检测DCs表型CDllc、MHC I、CD80、CD86等变化。将Ad-eGFP感染DCs,流式细胞术检测感染效率来获得最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)值。按照最佳MOI值,将Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL感染DCs, western blot检测DCs表达4-1BBL的水平,流式细胞术分析DCs表达共刺激分子CD80/86、CD11c强度及抗凋亡能力。混合淋巴细胞反应观察DCs刺激同基因型BALB/c小鼠脾T淋巴细胞增殖能力。最后,观察DCs疫苗诱导抗前列腺癌特异性免疫效应。构建真核表达载体pcDNA3.1-tPSMA,然后将pcDNA3.1-tPSMA质粒转染前列腺癌细胞系RM-1,G418筛选出稳定表达tPSMA的细胞株(RM-1-tPSMA)。RT-PCR、western blot和间接免疫荧光检测RM-1-tPSMA细胞表达tPSMA的水平。将感染Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL、Ad-eGFP和未感染的DCs与脾T细胞混合培养两次,ELISA检测培养上清液中的IL-4、IL-10和IFN-γ浓度,免疫印迹测定活化的T细胞表达P38和IκKB-α情况,流式细胞术分析T细胞表达抗凋亡蛋白Bcl-xL水平。另外,将活化的T细胞收集后,分别与靶细胞RM-1-tPSMA和RM-1培养,CCK-8法检测T细胞对靶细胞的特异性杀伤率,Annexin-FITC/PI试剂盒检测T细胞凋亡情况。在动物模型上,将RM-1-tPSMA细胞悬液接种小鼠腹肋侧皮下,分别观察各组DCs疫苗在肿瘤免疫预防和免疫治疗研究中对瘤体生长情况的影响,以及肿瘤组织的HE染色形态和凋亡情况。结果：通过DNA序列测定、PCR鉴定,本研究成功构建共表达tPSMA和m4-1BBL的重组腺病毒(Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL)和携带eGFP的对照腺病毒(Ad-eGFP),滴度分别为6.3×109PFU/ml和7.5×109PFU/ml。免疫印迹显示重组腺病毒Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL能在RM-1细胞里正常表达tPSMA和m4-1BBL。利用重组细胞因子GM-CSF和IL-4在体外可成功诱导DCs,倒置显微镜和电镜下可见典型的DCs形态结构。流式细胞术显示DCs表达CD11c、MHC I、CD80、CD86等表型。将Ad-eGFP感染DCs,流式细胞仪检测DCs的GFP表达率,台盼蓝检测DCs存活率。结果显示GFP表达率呈MOI依赖性,而DCs存活率随着MOI值增加则逐渐下降。当MOI为300时,感染效率和DCs存活率处于平衡位置,感染效率为65.6%,存活率达93%,遂取该值为最佳MOI值。免疫印迹显示重组腺病毒Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL感染DCs后,4-1BBL表达高于对照组,流式细胞术结果表明感染Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL的DCs表达CD80/86分别为(81.6±5.4)%、(80.13±2.81)%,较对照组DCs/Ad-eGFP及空白对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),而凋亡率为16.4%,较对照组Ad-eGFP感染的DCs及未感染的DCs低,差异有统计学意义(P<0.05)。混合淋巴细胞反应中,Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL感染的DCs刺激T细胞增殖能力明显高于Ad-eGFP感染的DCs组和未感染的DCs组。通过RT-RCR、western blot和间接免疫荧光法的鉴定,本研究成功筛选稳定表达tPSMA的细胞株RM-1-tPSMA。ELISA结果表明感染Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL的DCs可诱导增强的T细胞IFN-γ分泌水平(1330.16±251.02) pg/ml,较对照组DCs/Ad-eGFP (154.73±40.92) pg/ml及空白对照组(114.36±20.37) pg/ml明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),而IL-4和IL-10水平三组之间差异无统计学意义。免疫印迹显示Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL感染的DCs能诱导T细胞下调IκB-α表达水平,但上调P38磷酸化水平,总的P38蛋白不受影响。流式细胞术发现感染Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL的DCs诱导T细胞活化时表达Bcl-xL强度为(93.2±10.36)%,明显高于对照组DCs/Ad-eGFP (65.8±5.17)%及空白对照组(53.46±6.04)%,差异有统计学意义(P<0.05),说明Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL感染的DCs能诱导T细胞上调抗凋亡蛋白Bcl-xL表达水平。数据显示感染Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL的DCs可诱导产生明显的靶细胞RM-1-tPSMA特异性CTL杀伤活性,随着效应细胞与靶细胞的比值增加,CTL杀伤能力也随之增强,当比值为50时,CTL杀伤能力最高,其杀伤率达(53.5±3.12)%,明显高于对照组DCs/Ad-eGFP及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而对靶细胞RM-1细胞,三组DCs均未诱导明显的CTL靶细胞杀伤效应。另外,感染Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL的DCs诱导CTL的凋亡率为(10.51±1.02)%,明显低于对照组DCs/Ad-eGFP (22.16±2.35)%及空白对照组(26.85±3.04)%,差异有统计学意义(P<0.05)。在动物模型上,肿瘤免疫预防和肿瘤免疫治疗结果均发现DCs/Ad-tPSMA-IRES-m4-1BBL免疫的小鼠瘤子生长受抑制,体积较DCs/Ad-eGFP组、DCs组及PBS组小,差异有统计学意义(P<0.05),而在肿瘤组织中凋亡细胞较DCs/Ad-eGFP组、DCs组及PBS组明显增多。结论：本研究利用重组腺病毒载体介导人前列腺癌相关抗原tPSMA和鼠4-1BBL共刺激分子修饰树突状细胞,在体外和体内研究中发现tPSMA和4-1BBL修饰的树突状细胞能增强T细胞的活化,诱导tPSMA特异性的细胞毒T淋巴细胞抗前列腺癌效应,为探寻前列腺癌免疫治疗提供方法基础。