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真菌发酵生产紫杉醇因其生物可控性、资源可持续性而具有广阔的市场前景。但是真菌发酵液中产物众多,而且黏度很大,这就给后期的分离纯化增加了困难,同时也带来了成本的提高。
论文首先对液相色谱法检测该真菌发酵物中紫杉醇的条件进行了优化,结果表明最佳条件为甲醇:水(v/v)=70:30,柱温35℃,流速1.0ml/min。在该条件下,绘制了紫杉醇的标准曲线,得到的方程为y=22171073x+35009在浓度范围10μg/mL~100μg/mL之间线性良好,r=0.9992(n=6)。
固相萃取技术是液相色谱中应用很广的一种前处理技术。我们分别考察了两种填料的C18(YWG和Fuiji)和碱性氧化铝固相萃取作为前处理手段的效果,并且对其进行了优化和改良。结果表明:C18填料的固相萃取采取活化、上样、水淋洗、20%甲醇淋洗和80%甲醇洗脱的步骤较佳,Fuji和YWG回收率分别为44.7和56.5%左右。经过改良后的碱性氧化铝固相萃取采用有机溶剂直接洗脱,不仅将紫杉醇直接洗脱,同时节省了有机溶剂和处理时间,而且回收率均高于100%,在采用氯仿作为洗脱溶剂,反复洗脱5次时,回收率为113%,采用乙酸乙酯为洗脱溶剂,反复洗脱3次的条件下,效果最佳,回收率也达到了136%。这可能是由于碱性氧化铝催化紫杉醇类似物生成了新的紫杉醇。经过质谱鉴定,所收集的紫杉醇具有和紫杉醇标准品一样的离子峰。因此,碱性氧化铝固相萃取是紫杉醇前处理的有效手段。
分子印迹技术具有良好的特异性、目的性,广泛应用于氨基酸分离和药物分析等领域。首次研究了紫杉醇的分子印迹整体柱技术。结果表明分子印迹效果和不锈钢柱管长度以及合成温度密切相关。选用同样的比例,不锈钢柱管的长度不同,合成温度不同,则效果也会差别很大。同时考虑到成本降低,所以采用了不锈钢柱管的长度为10cm较佳。