膀胱移行细胞癌（Transitional cell carcinoma，TCC）是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤。膀胱癌手术后约55％～60％的病例出现复发，其中16％～25％的肿瘤恶性程度增加。膀胱癌术后复发和进展一直是困扰临床医生的难题，其术后的辅助治疗和长期随访也极大地增加了患者的医疗费用和痛苦。因此，探索膀胱癌发生发展的分子生物学机制和遗传学本质，为肿瘤的靶向性治疗提供理论基础，是临床和科研上急需解决的重要课题。近年来的研究发现抑癌基因启动子区CpG岛（CGI）甲基化能阻碍该基因转录，是许多恶性肿瘤发生发展的重要原因。CGI异常甲基化是表观遗传学研究的重要内容，DNA甲基化使肿瘤抑癌基因沉默也是Knudson’s“两次打击论”中除杂合性缺失（LOH）外的重要内涵。死亡相关蛋白激酶（Death Associated Protein Kinase，DAPK）定位于染色体9q34.1，是一种Ca²⁺/CaM依赖性的丝／苏氨酸蛋白激酶。研究发现DAPK可通过一系列通路参与诱导凋亡的正向调节。DAPK在多种肿瘤细胞和组织中出现表达丢失，而且该表达缺失也与其CpG的甲基化改变密切相关。本研究在体外细胞水平和临床标本两个层面探讨DAPK基因CpG岛异常甲基化在膀胱癌中的意义和机制。首先采用RT-PCR和Western-blot检测三种不同膀胱癌细胞系（T24，5637，ScaBER）中DAPK基因的表达状态，然后用BSP（bisulfite sequencingPCR）方法分析各细胞中DAPK基因启动子区CpG岛的甲基化状态。分别用甲基转移酶（DNMT）抑制剂5-aza-deoxycytidine和阿霉素处理细胞后用上述方法检测DAPK的甲基化改变与基因表达的关系。用流式细胞仪检测不同处理组细胞的凋亡率，分析DAPK基因的表达与细胞凋亡之间的关系。体外转染DAPK基因至该基因表达缺失的T24细胞中，进一步研究DAPK基因在膀胱癌细胞的生物学功能。在细胞水平的研究基础上，选择临床正常膀胱粘膜上皮和膀胱肿瘤标本用MSP（methylation specific PCR）方法检测不同组织标本中DAPK基因CpG岛的甲基化状态，同时采用Western-blot和免疫组织化学染色来分析不同组织中DNMT1和DAPK的表达，探讨DAPK基因的甲基化改变与肿瘤临床特点之间的关系和机制。第一部分人膀胱癌细胞中DAPK基因甲基化状态的分析人类基因组DNA中的CpG岛处于甲基化压力和甲基化保护的动态平衡中。在某些目前尚不明确的因素作用下这种平衡被打破，甲基化逐渐由不影响基因表达周边区向决定基因转录的核心区扩散，经过一系列复杂的反应，最终使核小体结构变得紧密，阻止转录因子的结合，从而使基因表达沉默。DNA甲基化改变使抑癌基因沉默在肿瘤发生发展中具有意义，这是目前肿瘤表观遗传学研究的重要内容。本实验中，我们选择三种不同膀胱癌细胞（T24，5637，ScaBER）进行体外实验研究。首先采用半定量RT-PCR和Western-blot分别检测三种膀胱癌细胞中DAPK基因的表达。免疫荧光技术分析DAPK基因的亚细胞定位。用甲基化特异PCR（MSP）方法检测三种细胞中的DAPK基因启动子甲基化状态。观察甲基转移酶（DMNT）抑制剂5-aza-CdR（5-aza-CdR）对各细胞中的基因表达和甲基化状态的影响。用流式细胞术检测细胞凋亡情况，并分析DAPK的表达与膀胱癌细胞凋亡的关系。结果发现T24细胞中未检测到DAPK基因的表达，也未检测到启动子甲基化；5637细胞中该基因表达水平极低，在ScaBER细胞中该基因的表达较前两者要高。5637细胞和ScaBER细胞中均有甲基化改变。2.5μmol／l浓度的5.aza-CdR作用72h可以有效上调5637和ScaBER细胞的DAPK基因的表达。流式细胞术检测发现5-aza-CdR处理细胞后，其DAPK表达上调，同时细胞凋亡率也显著增高。从本实验中我们得出如下结论：（1）、抑癌基因DAPK的表达异常与移行细胞癌的发生发展有重要联系，且基因启动子区CpG岛的异常甲基化在调节DAPK基因的表达中发挥重要作用：（2）、DAPK基因的表达上调可以明显促进肿瘤细胞凋亡；（3）、在膀胱癌细胞中，DAPK基因的表达调控还存在CpG岛甲基化以外的机制参与。（4）、5-aza-CdR可以抑制甲基化，从而逆转基因的表达。第二部分DAPK基因在膀胱癌细胞中的表达调控及其促凋亡作用的相关机制研究在前期的研究工作中，我们已经证实了膀胱癌细胞中DAPK基因存在甲基化改变，而且这种改变对基因的表达调控发挥重要作用。在本实验中我们将要探讨两个方面的问题。其一是DAPK基因启动子甲基化对基因转录调控的分析，其二是DAPK基因生物学功能的初步研究。首先我们采用BSP（bisulfite sequencing PCR）方法检测DAPK表达差异的两组膀胱癌细胞5637和ScaBER中的DAPK基因启动子甲基化状态，并分析启动子内不同区段内CpG位点的甲基化对转录的调控作用，从而寻找到膀胱癌细胞中对DAPK基因表达调控起决定作用的启动子核心区域，为将来的肿瘤靶向治疗提供依据。为进一步研究DAPK基因在肿瘤细胞中的生物学功能，我们将全长DAPK基因序列转入该基因表达缺失的T24细胞中。通过划痕实验检测DAPK基因的抑制迁移作用，采用流式细胞术分析转染DAPK前后肿瘤细胞凋亡率的改变。此外，我们还研究了临床膀胱癌辅助化疗药物对DAPK基因表达的影响，并对其机制进行了初步的研究。实验研究发现，膀胱癌细胞中DAPK基因启动子的核心区域位于转录起始位点附近，该区域的CpG位点甲基化较大程度上决定了DAPK基因的表达状态。体外瞬时转染全长DAPK基因序列至T24细胞后检测到其蛋白表达。流式细胞术检测发现转染DAPK基因的T24细胞细胞凋亡率由0.09％上升到24.15％。划痕法检测到转染DAPK后T24细胞迁移能力显著下降。将不同浓度的阿霉素作用于5637细胞后发现DAPK基因的蛋白表达水平明显上调，从0.01μg／ml至1μg／ml的浓度范围内该作用具有剂量依赖性。Western-blot检测发现阿霉素作用后细胞DNMT1表达下降，而且通过BSP分析证实阿霉素可以改变DAPK基因启动子核心区域的CpG位点甲基化状态。从本实验中我们得出如下结论：（1）、抑癌基因DAPK基因启动子的核心区域位于转录起始位点附近；（2）、体外转染DAPK基因可以显著影响膀胱癌细胞的生物学行为；（3）、临床常用的膀胱肿瘤化疗药物阿霉素可以通过影响CpG岛的甲基化状态来上调DAPK基因的表达，这可能是阿霉素抗肿瘤作用的另外一个机制。第三部分DAPK基因CpG岛的异常甲基化改变在人膀胱癌组织中的意义在体外细胞水平研究的基础上，本实验选择临床组织标本进一步探讨DAPK基因CpG岛异常甲基化在我国膀胱癌发生发展中的意义。选择临床新鲜的膀胱癌组织标本24例以及相应的癌旁组织22例进行实验研究。本实验主要包括三个内容：（1）、MSP法检测各组织中DAPK基因的甲基化状态；（2）、Western-blot和免疫组织化学染色验证DAPK基因在各组织中的蛋白表达水平；（3）、Western-blot检测各样本中甲基转移酶1（DNMTl）的表达状态。MSP检测结果发现在膀胱癌组织中有14例（14/24，58.3％）检测到DAPK基因的甲基化改变，而正常组织中均未检测到DAPK基因甲基化。甲基化改变与肿瘤病理分级无显著相关性，但是与肿瘤肌层侵润（P=0.0446）及复发（P=0.0337）有关。Western-blot检测发现DAPK在肿瘤组织中（8/24，33.3％）表达显著低于正常组织（18/22，81.8％），且甲基化阳性的组织中DAPK表达缺失，但DAPK的表达与肿瘤的分级分期无显著相关性。免疫组织化学染色结果显示DAPK基因表达于细胞浆及胞膜，其表达量与Western-blot检测结果相一致。Western-blot检测结果发现在肿瘤组织中18例（18/24，75％）DNMT1表达阳性，且在甲基化阳性的肿瘤组织中均检测到DNMT1的表达，正常组织中未检测到其表达。从以上结果可以得出如下结论：（1）、DAPK基因失表达和CpG岛甲基化与膀胱肿瘤的发生密切相关。（2）、肿瘤组织中DNMT1的高表达提示其在调节肿瘤组织抑癌基因甲基化中发挥重要作用。（3）、DAPK基因的甲基化与肿瘤侵润和复发有显著的相关性，这提示DAPK甲基化改变可以作为肿瘤预后的一个分子指标。创新点及意义1．通过检测DAPK的甲基化状态和基因表达，证实了DAPK基因CpG岛异常甲基化在下调基因转录中具有重要的作用，而且该调节作用可以被甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR所逆转。2．通过BSP测序分析找到了DAPK基因启动子CpG岛的核心区域位于转录起始位点附近；体外转染DAPK基因证实了其促进凋亡和抑制肿瘤细胞迁移的生物学作用；为膀胱癌的分子靶向治疗提供了研究基础。3．通过临床标本的研究发现DAPK基因甲基化与膀胱癌肌层侵润和复发具有显著的相关性，提示DAPK基因甲基化可以作为膀胱癌复发和预后监测的表观遗传学指标。