论文部分内容阅读
研究目的:
真核细胞中X盒结合蛋白1(X-box binding protein1,XBP1)作为一种转录活化因子发挥着多种不同的功能,具有广泛的生物学效应,参与机体的多种生理及病理过程,其对疾病发生及发展的影响是近年来研究的热点。本研究首先运用多聚酶链式反应(PCR)、基因克隆等分子生物学技术构建了重组质粒pET32a-XBP/u,通过将其转化入大肠杆菌E.coli BL21,得到大量包涵体表达的目的蛋白XBP1u,利用Nj2+-NTA树脂对目的蛋白进行纯化,之后进一步应用Western blot对纯化的目的蛋白进行分析,以鉴定得到的纯化XBP1u蛋白,用该纯化蛋白免疫家兔制备抗XBP1u多克隆抗体,从而为进一步研究XBP1u的生物学功能及其他相关后续研究奠定基础。
研究方法:
(1)使用总RNA提取试剂盒(TRIZOL试剂盒)从肝癌细胞(HepG2)中提取总RNA,并利用RT-PCR两步法扩增出目的片段XBP1u。
(2)利用分子克隆技术将目的基因克隆到pGEM-T载体上,构建成重组载体pGEM-T-XBP1u。
(3)利用分子克隆技术构建原核表达载体pET32a-XBP1u。
(4)将重组载体pET32a-XBP1u转化入大肠杆菌E.coli BL21,用IPTG诱导转化菌大量表达,得到目的蛋白XBP1u,SDS-PAGE分析其表达形式,并利用Ni2+-NTA树脂对目的蛋白进行纯化,之后用BCA法测定所表达的目的蛋白浓度。
(5)利用Western blot鉴定目的蛋白的正确性。
(6)用纯化后的目的蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。
(7)ELISA检测兔抗XBP1u血清的效价。
(8)Western blot检测兔抗XBP1u血清的特异性。
研究结果:
(1)扩增出了目的基因片段XBP1u,经测序XBP1u由785bp组成,为编码261个氨基酸残基的多肽。
(2)成功构建了原核表达载体pET32a-XBP1u,并转化入大肠杆菌E.coli BL21。
(3)经IPTG诱导大量表达后,SDS-PAGE电泳显示目的蛋白相对分子量为33KD,主要以包涵体形式表达,经NI2+-NTA柱纯化后,纯度达90%以上,BCA法测得蛋白质含量为1.42mg/ml。
(4)Western blot对目的蛋白进行分析,由于重组载体pET32a-XBP1u中的pET32a带有His标签,因此可以采用anti-His抗体和anti-XBP1u抗体同时检测XBP1u的抗原性。
(5)ELISA检测兔抗XBP1u血清效价为1:64000。
(6)免疫印迹检测兔抗XBP1u血清的特异性。
结论:
成功构建pET32a-XBP1u原核表达质粒,转化到大肠杆菌E.coliBL21表达菌获得了目的蛋白XBP1u,表达量较高,纯度较高;并进一步制备了纯度较高的抗XBP1u多克隆抗体,为研究XBP1u的生物学功能及其他相关后续研究奠定基础。