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作为哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质,γ-氨基丁酸(GABA)具有降血压、健肝利肾、增强记忆、促进睡眠等多种生理功能,在食品、医药、化工等行业具有广泛用途。通过乳酸菌发酵生产GABA以满足其日益增长的商业需求是人们的普遍共识,了解乳酸菌谷氨酸脱羧酶(GAD)系统基因表达情况,并通过代谢工程、蛋白质工程和发酵调控等手段提升乳酸菌GABA生产性能具有重要意义。本研究首先以GABA高产菌株Lactobacilaus bbrevis CGMCC1306为研究对象,解析了在不同培养条件下菌株GAD系统关键基因的表达差异;其次,克隆了植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GAD(具有相对较宽pH催化活性范围)基因并对其进行分子改造,获得了在近中性pH条件下仍具有较高催化活性的突变体GadBC378S,并将该突变酶在Lb.brevis CGMCC1306中过表达,提高了菌株的GABA合成能力。论文主要研究结果如下:(1)以Lb.brevisCGMCC1306为研究对象,在外源添加二环己基碳二亚胺(DCCD)弱化细胞F1Fo-ATPase酶活的情况下,考察菌体生长代谢情况和其GAD系统中关键基因gadA、gadB和gadC的转录水平。结果表明:不同程度弱化F1Fo-ATPase活性会导致该菌菌体生长受到不同程度的抑制,且高浓度DCCD会导致细胞裂解死亡;采用低浓度的DCCD适当抑制F1Fo-ATPase酶活可以加快Lb.brevisCGMCC1306在兼性厌氧条件下细胞内的糖酵解速率,并提高GAD系统关键基因gadB和gadC的表达水平(对数后期时较对照组分别提高25.09%和37.65%;稳定期时较对照组分别提高11.03%和32.5%),从而提高菌体细胞的GABA合成速率。(2)以获取具有相对较宽pH催化活性范围的Lb.plantarumGAD(GadB)为目标,采用溶钙圈法和目的基因PCR筛选法获得了两株具有GABA合成能力的植物乳杆菌Lb.plantarum GM1403与Lb.plantarum PF1409,然后克隆了这2个菌株的gadB基因,并以pET28a表达载体,分别在E.coli BL21(DE3)中进行了重组表达研究,实现了2个酶的可溶性表达。在此基础上,考察了这两个酶的酶学性质,发现两种酶最适温度和pH相同(分别为40 ℃和pH 5.0),但是来源于这两个菌株的GadB具有更宽广的pH催化范围:当pH值升高至5.6时,不仅仍具有催化活性,而且相对酶活高达34.5%,远高于其它乳酸菌源的GAD相对酶活。(3)为进一步提高Lb.plantarum GM1403 GadB在中性条件下的催化活力,本研究构建了截短C末端的GadB△11突变体并通过定向进化的方法获得了该突变体的突变文库,利用建立的高通量筛选法(基于pH敏感指示剂甲酚红的比色法),在近中性条件下筛选获得了一个较好的突变体C378S:该突变体在pH值为6和7时,酶活性分别是GadB△11的1.48倍和2.03倍。在最适反应条件下(pH 5.0,40℃,C378S 的Km 为 19.03 mM,且与 GadB△11 相似。在Lb.brevis CGMCC 1306中,利用乳酸菌组成型表达载体pMG36e对突变体C378S进行异源过表达,结果表明重组菌株Lb.brevis/pMG36e-gadBc378s经过36 h发酵,GABA的产量可以达到38.47 g/L,较对照组的产量提升了 24%。