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目的:本实验以小鼠和小鼠巨噬细胞为材料,使用布鲁氏菌疫苗株M5对其进行侵染,在不同的时间对小鼠的巨噬细胞、血清以及不同组织中的一氧化氮(NO)和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)含量进行检测,比较不同时间和不同组织内NO和ADMA含量的的差异,探讨NO和ADMA在此过程中所起的作用,以及NO与ADMA之间在时间和空间上的响应关系。最后进行CFU计数观察,为进一步研究其引起吞噬细胞免疫应答的开始和布病预防寻求新途径提供一定依据和理论支持。方法:1.收集培养至对数期的布鲁氏菌疫苗株M5菌液,离心重悬后用麦氏比浊法将菌液稀释至所需的浓度,用布鲁氏菌疫苗株M5侵染小鼠巨噬细胞,侵染时细菌和细胞比例为100:1,在0.5h、6h、12h、24h和48h时分别取细胞培养液和细胞裂解物,采用Griess试剂法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞内外的NO和ADMA含量,而后对各个侵染时间段进行CFU计数观察。把检测结果输入到EXCEL中,实验结果统计分析使用SPSS 17.0。2.用1中的方法培养布鲁氏菌疫苗株M5,用布鲁氏菌M5和PBS缓冲液分别对侵染组和对照组小鼠进行腹腔注射,注射剂量为0.2 m L(1.0X 106 CFU/只),分别在第3d、7d、14d和28d时处死小鼠,摘下小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,并用摘眼球法得到血液,首先用小鼠的血清进行虎红平板凝集(RBPT)和试管凝集检测(SAT),再用Griess试剂法和ELISA法测定对照组和侵染组不同组织和血清中的NO和ADMA含量,把检测结果输入到EXCEL中,实验结果统计分析使用SPSS 17.0。对小鼠肝脏和脾脏的各个侵染时间段进行CFU计数观察,并对随机CFU单菌落进行PCR鉴定,以进一步证明长出的菌落是布鲁氏菌M5。结果:1.巨噬细胞被布鲁氏菌M5侵染后NO含量呈上升趋势,细胞外的NO含量显著高于细胞内NO含量(P<0.05),和对照组相比差异显著(P<0.05);而随着侵染时间的不断增加,巨噬细胞内外的ADMA含量与NO含量变化趋势呈现出负相关(胞外-0.986,胞内-0.982),与对照组相比均差异极显著(P<0.01)。结合CFU计数结果,表明NO对布鲁氏菌的抑制作用只发生在侵染侵染0.5h~12 h,在侵染12h~48 h NO对布鲁氏菌的生长并未起到抑制作用,而ADMA在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞过程中对NO的生成有一定的抑制作用。2.用布鲁氏菌M5侵染小鼠后,RBPT和SAT实验在14d时检测到有阳性反应。侵染组和空白对照组NO总含量上变化不大,但侵染组血清中的NO含量随时间出现下降,而肝脾中NO含量随时间出现上升,其他各组织NO含量波动不明显。而ADMA的总趋势与NO相反。CFU计数结果显示,小鼠肝脾内布鲁氏菌的数量在14d时一直处于增长状态,28d时布鲁氏菌的数量下降,表明布鲁氏菌的分裂繁殖和机体NO的含量存在一定的关系。结论:1.经过检测,小鼠巨噬细胞在被布鲁氏菌侵染的过程中,ADMA对NO的释放存在抑制作用,NO在此过程中对布鲁氏菌的繁殖也存在一定的抑制作用,但在侵染后期作用不明显。2.对布鲁氏菌侵染后的小鼠血清和各组织中NO、ADMA含量进行检测后发现,各组织中的NO含量在侵染过程中变化有差别,血清中NO含量在侵染后下降,而在肝脾中的含量出现上升,ADMA的总趋势与NO相反,结合CFU计数结果,说明布鲁氏菌病侵染小鼠后免疫器官对其有一定的抑制作用,ADMA可抑制NO的生成。