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肥胖是影响人类健康的常见病。肥胖与交感神经活动过度增强存在着很大的相关性。脂肪传入反射(adipose afferent reflex,AAR)是化学刺激白色脂肪(white adipose tissue,WAT)引起的交感神经兴奋性反射。室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是AAR的主要中枢调节位点。交感神经活动是促进脂解的重要机制,对于机体脂肪总量和体重的调节具有非常重要的作用。但令人困惑的是肥胖时AAR明显增强,同时伴有交感神经传出活动增多和血压增高,但此时脂解的能力似乎没有发生相应改变,并不能有效对抗肥胖的发生。本研究探讨:(1)PVN中超氧阴离子调节AAR和交感神经活动的机制;(2)肥胖大鼠增强的AAR与减弱的脂解效应及其机制。第一部分:室旁核超氧阴离子调节大鼠脂肪传入反射和交感神经活动背景AAR是化学刺激作用于WAT传入神经引起的交感神经兴奋性反射。抑制PVN神经元活动或损毁PVN神经元均可消除AAR,表明PVN是调节AAR的重要中枢核团。我们过去的研究发现,PVN内超氧阴离子水平升高可引起交感神经活动增强和血压升高。本实验拟探讨PVN中超氧阴离子对AAR的调节作用及其机制。目的1.探讨PVN内超氧阴离子是否参与调节AAR。2.探讨PVN内激活的离子型谷氨酸受体是否参与了AAR引起的超氧阴离子水平的增加。方法实验采用雄性Sprague–Dawley大鼠,体重350-400 g,腹腔注射乌拉坦和氯醛糖麻醉。在大鼠右侧腹股沟白色脂肪(inguinal white adipose tissue,i WAT)4个位点注射辣椒素(8nmol/8μl每个注射位点)引起AAR,以引起的肾交感神经活性(renal sympathetic nerve activity,RSNA)和平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)变化评价AAR,采用Powerlab生物信号采集系统实时记录RSNA和MAP,使用立体定位技术和微量注射泵进行双侧PVN注射。使用DHE荧光探针和化学发光法检测PVN超氧阴离子水平。结果1.PVN微量注射超氧阴离子清除剂PEG-SOD、tempol或NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin显著降低基础RSNA和MAP,并抑制i WAT注射辣椒素引起的AAR。2.iWAT注射辣椒素增加双侧PVN超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。iWAT去神经预处理后,注射辣椒素不再引起PVN超氧阴离子水平增高。3.PVN微量注射NMDAR或非NMDAR激动剂增加PVN内超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。PVN单独注射NMDAR或非NMDAR拮抗剂未达到统计学差异,而联合应用NMDAR和非NMDAR拮抗剂明显降低PVN内超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性。4.单独应用NMDAR拮抗剂抑制i WAT注射辣椒素引起的PVN内超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性的增加,而单独应用非NMDAR拮抗剂则未能引起显著变化。PVN联合应用NMDAR和非NMDAR拮抗剂明显抑制i WAT注射辣椒素引起的PVN内超氧阴离子水平和NAD(P)H氧化酶活性的增加。结论PVN内NAD(P)H氧化酶来源的超氧阴离子紧张性调节AAR。PVN内离子型谷氨酸受体激活与AAR引起的PVN内超氧阴离子水平增加有关。第二部分肥胖大鼠增强的脂肪传入反射与减弱的脂解效应及其机制背景交感神经活动是调节脂解的重要机制,交感神经兴奋时,末梢释放去甲肾上腺素,激活β肾上腺素受体引起脂解。化学刺激WAT引起的AAR导致交感神经活动的增加。这种大脑和WAT之间的相互作用可能通过改变交感神经的活动来实现对脂解的调控。我们发现高脂饮食导致的大鼠肥胖模型中AAR明显增强,并与交感神经活动和血压增高有关,但令人困惑的是肥胖时过度激活的AAR和交感神经活动并没有降低脂肪总量及体重。本研究在正常大鼠、高脂饮食诱导的肥胖动物模型和原代脂肪细胞进行,着重于探讨肥胖时增强的AAR对脂肪细胞脂解的作用及分子机制。目的1.探讨AAR对脂解的调节作用。2.探讨肥胖状态下脂肪细胞对AAR敏感性降低的分子机制。方法实验选用体重在300-350 g之间的雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠(n=90),随机分为两组。其中一组给予正常饮食(食物中脂肪提供总热量的12%)作为对照,(Ctrl,n=30)。另一组给予高脂饮食(食物中脂肪提供总热量的42%)连续12周诱导肥胖的发生(HFD,n=60),12周后,大鼠根据各自体重的增加值进行随机分组,HFD组中体重大于Ctrl组最高体重的大鼠作为肥胖大鼠(obese rats,OB)。大鼠腹腔麻醉后进行急性实验。大鼠右侧i WAT内4个位点注射辣椒素(8nmol/8μl每个注射位点)引起AAR或电刺激器刺激附睾白色脂肪组织(epididymal white adipose tissue,e WAT)传入神经引起AAR,采用Powerlab生物信号采集系统实时记录RSNA和MAP。分离原代脂肪细胞。以异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导脂肪细胞脂解。商品化试剂盒检测血浆或孵育液中游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)和甘油水平,用酶联免疫吸附测定法检测去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)水平。Real-time PCR方法检测激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)基因的表达。Western Blot方法检测目的蛋白的表达。结果1.右侧iWAT注射辣椒素增加Ctrl组和OB组大鼠的RSNA和MAP,OB组的效应明显高于Ctrl组。OB组大鼠血浆NE和FFA明显高于Ctrl组,WAT注射辣椒素增加Ctrl组和OB组大鼠的血浆NE水平,并增加Ctrl组FFA水平,但OB组的血浆FFA水平增加达不到显著性差异。正常大鼠右侧iWAT注射辣椒素引起的AAR可被iWAT神经切除术所阻断。2.电刺激右侧eWAT传入神经增加Ctrl组和OB组大鼠的RSNA和MAP,OB组的效应明显高于Ctrl组。OB组大鼠血浆NE和FFA明显高于Ctrl组,电刺激右侧eWAT传入神经增加Ctrl组和OB组大鼠的血浆NE水平,并增加Ctrl组FFA水平,但OB组的血浆FFA水平增加达不到显著性差异。电刺激相邻皮下组织不能引起交感神经活动和脂解增加。3.OB组大鼠VAT和SAT内HSL mRNA水平均出现上调。Ctrl组与OB组大鼠VAT和SAT内HSL蛋白表达量无明显差异。辣椒素引起的AAR导致Ctrl组与OB组大鼠VAT和SAT内HSL蛋白(Ser660和Ser563)磷酸化水平均明显增高,OB组大鼠VAT和SAT内HSL蛋白(Ser660和Ser563)磷酸化效应明显低于Ctrl组,HSL蛋白Ser565位点磷酸化水平在各组中均无显著性差异。此外辣椒素引起AAR作用在Ctrl组VAT引起的Ser563位点磷酸化水平较SAT明显增加。4.OB组大鼠VAT和SAT内β1和β3受体mRNA和蛋白表达都减少。OB组大鼠和Ctrl组大鼠VAT和SAT内β2受体mRNA和蛋白表达均无明显差异。5.ISO作用于OB组VAT和SAT原代脂肪细胞诱导脂解的效应明显低于ISO作用于Ctrl组相应细胞的效应。ISO对Ctrl组VAT的脂解效应明显大于对SAT的效应。6.OB组大鼠VAT和SAT原代脂肪细胞内c AMP水平低于Ctrl组大鼠,ISO能增加细胞内cAMP水平,但ISO对OB组大鼠VAT和SAT的原代细胞cAMP水平的影响明显小于Ctrl组大鼠。7.应用cAMP类似物dbcAMP引起OB大鼠原代脂肪的脂解效应在程度上接近于ISO或dbc AMP引起Ctrl组的效应。8.dbc AMP引起OB组VAT原代脂肪细胞HSL蛋白(Ser660和Ser563)磷酸化的效应在程度上接近于ISO或dbc AMP引起Ctrl组的效应。结论肥胖时AAR增强而脂解减弱的机制与脂肪细胞β受体-cAMP-HSL通路的激活受损有关。增加cAMP水平可纠正肥胖模型减弱的脂解效应。