【摘 要】
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本文的主要目的是探究过表达自噬相关蛋白Atg5对主动脉瓣膜间质细胞自噬水平以及成骨样分化能力的影响,为钙化性主动脉瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路。从猪主动脉瓣上分离原代瓣膜间质细胞,细胞免疫荧光进行表型鉴定后,采用成骨培养基诱导瓣膜间质细胞成骨分化,并用Western blot检测细胞Runx2、OPN表达分析细胞成骨分化能力,WB检测p62和LC3B-Ⅰ/Ⅱ的表达分析胞内自噬水平;构建过表达A
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本文的主要目的是探究过表达自噬相关蛋白Atg5对主动脉瓣膜间质细胞自噬水平以及成骨样分化能力的影响,为钙化性主动脉瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路。从猪主动脉瓣上分离原代瓣膜间质细胞,细胞免疫荧光进行表型鉴定后,采用成骨培养基诱导瓣膜间质细胞成骨分化,并用Western blot检测细胞Runx2、OPN表达分析细胞成骨分化能力,WB检测p62和LC3B-Ⅰ/Ⅱ的表达分析胞内自噬水平;构建过表达ATG5的重组质粒pAdTrack-ATG5并通过脂质体转染瓣膜间质细胞,采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光染色检测转染pAdTrack-ATG5后细胞Atg5的表达水平和细胞自噬水平的变化情况;对成骨诱导培养的主动脉瓣膜间质细胞分别转染空载质粒和过表达Atg5质粒,利用Western blot检测72 h后瓣膜间质细胞早期成骨指标Runx2、OPN的表达,并利用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色方法检测Atg5对瓣膜间质细胞在诱导环境下的早晚期成骨样分化能力。结果显示,原代分离培养的瓣膜间质细胞的间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的染色结果呈阳性,内皮细胞标志物vWF的染色结果呈阴性;与对照组比较,用成骨培养基培养的瓣膜间质细胞Runx2、OPN和p62的蛋白表达显著增加,LC3B-Ⅰ/Ⅱ的比值显著下调;pAdTrack-ATG5经双酶切后的琼脂糖电泳结果以及测序结果显示,过表达质粒pAdTrack-ATG5构建成功;在转染pAdTrack-ATG5后,细胞Atg5的基因水平和蛋白水平均显著上调,p62蛋白表达水平显著下调,LC3B-Ⅰ/Ⅱ比值显著上调,免疫荧光染色显示,自噬小体聚集增加;与转染空载质粒组相比,转染pAdTrack-ATG5组细胞在成骨培养基培养72 h后成骨指标Runx2、OPN的蛋白表达水平显著下降,转染pAdTrack-ATG5组碱性磷酸酶染色和茜素红S染色结果的阳性程度均弱于转染空载质粒组。综上所述,过表达Atg5能上调细胞自噬水平,并抑制瓣膜间质细胞成骨样分化。
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