第一部分孕期开始的VAD对成年仔鼠学习记忆功能及组蛋白乙酰化修饰的影响目的：探讨从孕期开始的VAD对仔鼠成年期学习记忆功能及组蛋白乙酰化修饰的影响,以及RA信号通路与组蛋白乙酰化修饰二者的联系。方法：建立从孕期开始VAD的大鼠模型,实时监测VAN与VAD组仔鼠血清中VA浓度的变化；采用水迷宫行为学检测VAN和VAD组实验大鼠在8W龄时的学习记忆功能；用real-time PCR 和 western blot技术分别检测大鼠海马区RARa的基因和蛋白表达,同时用HAT活性检测法检测大鼠海马区的HAT活性,western blot技术检测乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4的蛋白表达,real-time PCR检测学习记忆基因Zif268、 cFOS、FosB的基因表达,CHIP-qPCR对Ac-H3、Ac-H4在两组大鼠海马区学习记忆基因启动子区域的富集情况进行检测；进而分别用real-time PCR 和 western blot技术检测组蛋白乙酰转移酶CBP、p300、 PCAF的基因和蛋白表达情况；最后用Co-IP和激光共聚焦技术对两组大鼠海马区RARa和CBP蛋白之间的相互作用情况进行检测。结果：(1)实时监测VAN与VAD组仔鼠血清中视黄醇浓度的变化：可见VAD组血清VA浓度在生后1D、3D、7D、2W、4W、8W均明显低于VAN对照组(p<0.001),并在8W龄进行水迷宫行为学检测：VAN组和VAD组大鼠均有学习记忆能力(p<0.001),但从孕期开始的VAD大鼠在8W龄时学习能力明显差于VAN组(p<0.05)；(2)大鼠海马区RARα的基因和蛋白表达：VAD组RARα表达较VAN组显著降低(p<0.01/0.001)； (3)大鼠海马区HAT活性、乙酰化组蛋白表达：VAD组大鼠海马区的HAT活性、乙酰化组蛋白表达显著降低(p<0.05/0.001)；大鼠海马区学习记忆基因表达：VAD组大鼠海马学习记忆基因(Zif268、cFOS、FosB)表达显著降低(p<0.01/0.05)；并且富集在记忆相关基因启动子区域的乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4蛋白水平亦显著降低(p<0.01/0.05)； (4)组蛋白乙酰转移酶(CBP、p300、PCAF)的基因和蛋白表达：VAD组CBP、p300的基因水平显著低于VAN组(p<0.01/0.05), PCAF在两组间无显著差异(p=ns)；CBP蛋白水平在VAD组表达显著低于VAN组(p<0.001),而p300、PCAF蛋白表达水平在两组间没有显著差异(p=ns)； (5)海马组织Co-IP和激光共聚焦检测RARα与CBP蛋白两者之间的相互作用：Co-IP实验发现RARα与CBP蛋白之间存在蛋白-蛋白相互作用,并且这种相互作用在VAD组要显著弱于VAN组(p<0.001)；激光共聚焦实验证实VAD组的RARα与CBP蛋白在海马三个分区(CA1、CA3、DG)的表达均要明显弱于VAN组,两者之间存在共表达,并且这种共定位在VAD组也要显著弱于VAN组(p<0.001)。结论： (1)成功建立了从孕期开始的VAD大鼠模型,并确证了孕期开始的VAD会引起成年期大鼠学习记忆功能的障碍； (2)VAD时大鼠海马区RARα的基因和蛋白表达显著降低； (3)VAD严重影响了大鼠海马HAT活性、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4以及学习记忆相关基因的表达; (4)VAD时大鼠海马区组蛋白乙酰转移酶CBP、p300、PCAF表达不同程度下降,其中CBP表达严重受损,VAD时HAT活性、Ac-H3、Ac-H4表达以及学习记忆相关基因表达的下降可能与CBP表达的下降密切相关； (5)VAD引起RA信号通路和组蛋白乙酰化修饰的显著改变,大鼠海马区RARα和CBP表达均显著降低,二者之间存在相互作用,并且这种相互作用在VAD组也显著低于VAN组。LARα口CBP相互作用异常可能在VAD所致学习记忆功能障碍中起重要作用。第二部分 RARα介导的RA信号通路对学习记忆相关的CBP依赖性组蛋白乙酰化修饰作用的调控机制第一章 RARα对学习记忆相关的组蛋白乙酰化修饰作用的调控机制目的：研究激活或抑制RARα介导的RA信号通路对CBP、HAT活性、乙酰化组蛋白以及学习记忆相关基因表达的影响。方法：培养胎鼠原代海马神经元,于培养的第六天用NSE做标记对神经元纯度进行鉴定。设定①RFP、②RFP+RA、③RA+siRARα、④ RA+Ad-RARa四个组,于培养的第六天,分别加入相应的RA或RFP、siRARα、Ad-RARα的重组腺病毒进行干预,于培养的第七天采用Real-time PCR分别检测RARα、CBP、记忆相关基因的RNA水平；CHIP-qPCR检测四个组神经元中RARα在CBP启动子上的富集情况；于培养的第九天检测各组的HAT活性,CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表达。结果：(1)胎鼠原代海马神经元生长情况良好、胞体饱满,突触逐渐增长、形成相互连接,经NSE免疫荧光鉴定,NSE阳性率>90%,纯度满足实验要求；(2)经RA处理后,RARa的基因和蛋白水平显著增高,RA+siRARα腺病毒作用后的神经元中RARα基因和蛋白表达水平显著低于RFP+RA组,经RA+Ad-RARα腺病毒处理后,RARα的mRNA和蛋白表达均达到最高,显著高于RFP+RA组(p<0.001/0.01);(3)CBP基因(p<0.001/0.01/0.05)和蛋白表达、HAT活性(p<0.001/0.01/0.05)、乙酰化组蛋白Ac-H4表达、记忆相关基因表达在四个组的表达趋势均同RARα的变化趋势基本一致,即RFP+RA组的表达水平显著高于RFP组与RA+siRARα组,而显著低于RA+Ad-RARa腺病毒处理组； (4)RARα富集在CBP启动子区域,并且富集的水平与RARα的表达趋势基本一致(p<0.001/0.01/0.05)。结论： (1)成功培养并鉴定了符合实验要求的胎鼠原代海马神经元 (2)获得了满足实验需求的相应的上调或下调的RARα信号；(3)RARα能够调控HAT活性、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游学习记忆相关基因的表达； (4)RARα不仅能够招募CBP成为辅激活子,还能直接调控CBP的表达水平,参与RA信号通路调控学习记忆基因的表达。第二章RARa介导的RA信号通路调控学习记忆相关信号中的CBP依赖性组蛋白乙酰化修饰机制目的：研究CBP信号对组蛋白乙酰化调控的特异性,以及其在RARa介导的RA信号通路调控学习记忆相关信号中的作用机制。方法：培养胎鼠原代海马神经元,于培养的第六天,设定(1)①NC、②siCBP两组； (2)③Ad-RARa+NC、④Ad-RARa+siCBP/C646两组； (3) ⑤RFP+NC、⑥RFP+RA+NC、⑦RFP+NC+siCBP三组。首先利用 (1) 中两个组别对四种 siCBP慢病毒(GR805/GR806/GR807/GR808)进行筛选和鉴定,选出具有最佳抑制效率和功能的siCBP慢病毒,然后在(2)、 (3)分组细胞中分别加入相应的RA、腺病毒、慢病毒或抑制剂进行干预,于培养的第七天采用Real-time PCR分别检测RARα、CBP、记忆相关基因的mRNA水平；于培养的第九天检测各组的HAT活性,CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表达。结果： (1)四种siCBP慢病毒感染原代海马神经元后CBP mRNA和蛋白表达有不同程度降低,抑制效果最佳的GR806对神经元的HAT活性及Ac-H3、Ac-H4表达均有显著抑制功能(p<0.001/0.01/0.05)；(2)在用Ad-RARa将RA信号通路激活的基础上,siCBP能够特异性地将激活的CBP基因(p<0.01)与蛋白表达显著抑制下来,并且神经元中HAT活性(p<0.05)、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4、记忆相关基因(p<0.001/0.05)的表达亦均被显著下调； (3)siCBP慢病毒作用于神经元后,CBP的基因表达显著降低(p<0.05),而RARα的基因表达未发生显著改变(p=ns)；CBP的抑制剂C646并没有使RARI-的蛋白产生显著下调； (4)用RA直接将RA信号通路激活后,CBP基因表达能被显著上调(p<0.05),在RA的基础上siCBP作用后,上调的CBP表达又被显著下调(p<0.05),相应地,下游乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4表达、记忆相关基因表达(p<0.01/0.05)在三个组的表达趋势均同CBP的变化趋势基本一致。结论：(1)筛选并验证获得了最佳抑制效率的siCBP慢病毒；(2)获得了满足实验需求的相应变化的RARα、CBP信号 (3)CBP能够特异性地调节神经元中HAT活性、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游学习记忆相关基因的表达； (4)RARα在CBP的上游,RA信号通路对学习记忆相关信号的调节是通过RARα介导的CBP依赖性组蛋白乙酰化修饰的调控实现的。