[研究背景]：　　 青蒿素类抗疟药是一类具有内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物。已有研究表明青蒿素(ART)口服吸收迅速但不完全，多剂量口服给药后的血药浓度-时间曲线下面积明显降低，具有自身诱导代谢现象。而该类药物的半衰期并没有随着血药浓度的下降而改变，所以推测该类药物的自身诱导代谢很可能是通过首过消除机制产生的。青蒿素类药物自身诱导代谢现象主要与CYP286有关，在该酶缺乏的情况下，CYP3A4也起次要代谢作用，且该类药物还能诱导CYP2C19。鉴于目前青蒿素类抗疟药临床以联合用药为主，且这类药物存在对CYP450的诱导作用，因此易发生药物间相互作用。这种自身诱导代谢不但会降低该类药物的治疗效果，还可能影响到与其联合应用的药物代谢水平。青蒿素及其联合使用的药物被清除代谢的程度大小取决于青蒿素类药物对药物代谢酶诱导作用的强弱以及药物的治疗窗范围。　　 孕烷X受体(HumanpregnaneX。receptor,hPXR)和组成型雄烷受体(Humanconstitutiveandrostanereceptor，hCAR)是CYP3A4和CYP286基因转录调节的关键因子。当外源性化合物进入细胞后，与细胞核内PXR受体的LBD区域结合，然后再与RXR结合形成异源二聚体，从而与CYP3A4基因反应元件相结合，启动基因的转录表达。利用在此分子机制上建立起来的hPXR和hCAR介导的CYP3A4和CYP286基因转录调节系统，可以了解外源性化合物对CYP3A4和CYP286的诱导作用机制，预测药物之间的相互作用，减轻或避免由此产生的不良影响。　　 已有动物和人体实验证明，青蒿素类药物主要经过肝脏的摄取被清除，且该类药物在肠上皮细胞和肝细胞中具有较高的浓度，而上述两个生理部位也恰是核受体hPXR和hCAR高表达部位，因此推测核受体hPXR和hCAR很可能是介导青蒿素类药物诱导CYP3A4和CYP286基因转录调节的关键因子，从而可在基因水平阐释该类药物的自身诱导代谢机理。青蒿素类药物是否通过激活孕烷X受体或者组成型雄烷受体而发挥对CYP450的诱导作用，目前尚不清楚。本文选择该类药物的母体化合物青蒿素和该类药物衍生物的共有活性代谢物双氢青蒿素(DHA)为模型药物，考察其对CYP3A4和CYP286的转录调节作用。阐明其自身诱导机制对优化该类药物结构，丰富其自身诱导代谢机理，指导临床合理用药，减少不良反应有着重要意义。　　 [目的]：探讨ART和DHA是否能通过激活核受体hPXR或hCAR对CYP3A4和CYP286产生转录调节作用。　　 [方法]：　　 1.建立双报告基因检测体系，并通过已知的阳性药物确证该体系的可靠性；在此基础上，优化hPXR和hCAR介导的CPY3A4和CYP286转录诱导转染体系，提高检测系统的灵敏度。利用invitrogen脂质体2000共同转染表达质粒hPXR/hCAR，报告基因质粒CYP3A4/CYP286和内参质粒pRL-TK于HepG-2细胞中。以hPXR的激动剂利福平，hCAR的激动剂CITCO为阳性对照组，以O.1％DMSO为溶剂对照组；通过调整三种质粒的转染比例，以RIF/DMSO和CITCO/DMSO的比活值，即阳性药物的诱导倍数作为优化系统灵敏度的指标，分别获得最大比值以表示系统具有最佳灵敏度。　　 2.通过MTT实验确定青蒿素和双氢青蒿素的药物干预浓度，选择小于IC50的药物浓度作为ART和DHA干预HepG-2细胞的测试浓度。　　 3.采用报告基因瞬时共转染的方法，分别以青蒿素（2、5、10、30、50、70μmol/L）和双氢青蒿素（1、3、5、10、15、20μmol/L）的浓度来干预己转染三种质粒的HepG-2细胞24小时，考察不同浓度药物对CPY3A4和CYP286的诱导作用即浓度效应。对于有诱导作用的药物浓度，分别干预细胞24h、48h、72h以考察药物诱导作用的时间效应。　　 4.通过裂解药物干预的细胞，释放出细胞编码的萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，用双萤光素酶检测试剂盒分别检测他们的活性值。用每孔测得的萤火虫萤光素值/同孔的海肾萤光素酶活性值得到该孔的校正值。用药物干预组每孔的校正值/DMSO孔校正值均值得到每孔的比活值，即药物组相对于DMSO组的诱导倍数。每组实验平行转染2次，每次设置3个复孔。采用SPSS11.0统计软件分析数据，以均数土标准差的形式表示诱导倍数。　　 [结果]：　　 1.建立了hPXR和hCAR介导的CPY3A4和CYP286药物诱导体外筛选体系，并通过优化转染体系提高了系统的灵敏度，且最终确定三种质粒的转染比例为pCDNA-hPXR/hCAR150ng∶pGL-CPY3A4/CYP28600ng∶pRL-TK50ng（共800ng）。　　 2.通过MTT实验确定了青蒿素的药物干预浓度为2、5、10、30、50、70μmol/L，双氢青蒿素的药物干预浓度为1、3、5、10、15、20μmol/L。　　 3.在考察青蒿素和双氢青蒿素通过hPXR介导的CYP3A4和CYP286转录调节实验中发现，青蒿素2、5、10、30、50、70μmol/L和双氢青蒿素1、3、5、10、15、20μmol/L等不同浓度干预HepG-2细胞24小时后，与0.1％DMSO溶剂对照组相比较均未产生明显的诱导作用(P＞0.05)，而阳性组利福平的诱导倍数均在4倍左右（(P＜0.001)）。　　 4.在考察青蒿素和双氢青蒿素通过hCAR介导的CYP3A4转录调节实验中发现，青蒿素在5、10μmol/L两个浓度可以通过激活hCAR受体对CYP3A4转录产生诱导作用，其诱导倍数分别为3.65±0.28(P＜0.01)和3.42±0.16（P＜0.01）。双氢青蒿素在1、3、5μmol/L三个低浓度可以通过激活hCAR受体对CYP3A4转录产生诱导作用，其诱导倍数分别为2.78±0.26(P＜0.05),2.89±0.32(P＜0.05),3.14±0.27(P＜0.01).　　 5．在考察青蒿素和双氢青蒿素通过hCAR介导的CYP286转录调节实验中发现，青蒿素在2、5、10、30μmol/L四个浓度可以通过激活hCAR受体对CYP286转录产生诱导作用，其诱导倍数分别为3.37±0.24(P＜0.01),3.14±0.31(P＜0.01),3.27±0.29(P＜0.01)，2.96±0.18(P＜0.05)。双氢青蒿素在1、3、5、10、15、20μmol/L六个浓度均可以通过激活hCAR受体对CYP3A转录产生诱导作用，其诱导倍数分别为3.24±0.21（P＜0.01）,3.37±0.29(P＜0.01),3.12±0.31(P＜0.01),3.08±0.19(P＜0.01),2.98±0.22(P＜0.05),2.76±0.23(P＜0.05)。　　 6．在考察具有诱导作用的青蒿素10μmol/L和双氢青蒿素5μmol/L的浓度时间依赖性实验中发现，二者的诱导作用均在48h具有最大值，青蒿素10μmol几通过hCAR介导，对CYP286和CYP3A4的最大诱导倍数分别为3.89±0.23(P＜0.01)和3.97±0.35（P±0.01）。双氢青蒿素5μmol几通过hCAR介导，对CYP286和CYP3A4的最大诱导倍数分别为4.12±0.35（P＜0.001）和3.94±0.31(P＜O.01)。　　 [结论]：　　 1.青蒿素和双氢青蒿素在测试浓度范围内未发现可以激活hPXR受体而诱导CYP3A4和CYP286的转录。　　 2.青蒿素和双氢青蒿素在不同的测试浓度范围内均可以通过hCAR受体对CYP3A4和CYP286的转录产生诱导作用，并且存在时间依赖性，说明青蒿素和双氢青蒿素可能是cyp3a4和cyp2b6基因的诱导化合物，并且该诱导机制可能是造成青蒿素类药物自身诱导代谢的主要原因。