纤维二糖磷酸化酶属于糖苷水解酶94家族(GH94),在纤维素的降解过程中具有重要作用。纤维素水解过程中,产物纤维二糖对外切葡聚糖酶具有严重的产物抑制效应,通常添加β-葡萄糖苷酶降解纤维二糖,以有效降低这种抑制。但是,当生物需要大量ATP进行生命活动时,这种降解纤维二糖的方式非常不利。研究发现,纤维二糖磷酸化酶能够催化纤维二糖可逆磷酸解,产生D-葡萄糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸(Glc P),每分子的纤维二糖经过磷酸解进入糖酵解代谢可节省1分子ATP,与β-葡萄糖苷酶相比具有能量优势。并且,微生物中磷酸解速率远大于水解速率,进一步表明磷酸化酶途径更具有优势。嗜热纤维二糖磷酸化酶热稳定性好、可与其它纤维素酶兼容,使其可以在生物燃料工业中抵抗不利环境,因此对新型嗜热细菌纤维二糖磷酸化酶的开发和研究十分必要。来自俄罗斯堪察加半岛热泉的热解纤维素真细菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725可在70-75℃的高温下正常生长,分泌表达丰富的纤维素酶类。该菌株的全基因组已经得到测序,对序列进行分析发现其基因组中共有两种潜在的纤维二糖磷酸化酶基因。我们对其中基因编号为ACM59592.1的纤维二糖磷酸化酶(Cb CBP)进行研究。我们克隆ACM59592.1基因,构建大肠杆菌基因工程菌,表达并纯化重组蛋白Cb CBP,详细表征重组蛋白Cb CBP的酶学性质。结果表明Cb CBP以胞内可溶性蛋白形式表达,经过热处理、镍柱亲和层析和阴离子交换层析纯化操作,Cb CBP达到电泳纯度。酶学性质分析表明,Cb CBP能够可逆的磷酸解纤维二糖,对纤维三糖及更高聚合度的纤维寡糖没有作用。磷酸解反应及合成反应的最适反应温度均为75℃,最适p H为7.0。该酶具有良好的热稳定性,在65℃下的半衰期为6h,在75℃下的半衰期为4h。一价金属离子(Na+、K+、NH4+)对磷酸解反应与合成反应影响很小,而二价金属离子以及有机试剂(SDS,DTT)则对磷酸解反应与合成反应分别产生了不同程度的促进或者抑制作用。合成反应底物特异性表明,Cb CBP对D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和D-甘露糖有特异性,并且进行了相应异质二糖的合成。发现p NPβG可作为纤维二糖磷酸化酶的糖基受体,合成p NP-糖苷。其他文献报道的纤维二糖磷酸化酶合成能力受到葡萄糖浓度(4-20m M)的强烈抑制,而Cb CBP的催化反应在葡萄糖浓度达到100m M时仍不受抑制。催化动力学数据结果显示,Cb CBP对纤维二糖的磷酸解效率最高,其kcat/Km值为6.57s-1m M-1,为序列催化机制:即底物Pi和纤维二糖依次与Cb CBP结合,产物葡萄糖和Glc P依次释放;合成反应中,以D-葡萄糖和Glc P为底物,其kcat/Km值为8.4s-1m M-1,催化机制为乒乓机制。本论文克隆、表达并系统表征了来源于热解纤维素真细菌(C.bescii DSM6725)的纤维二糖磷酸化酶Cb CBP,结果表明,该酶具有热稳定性好、高葡萄糖浓度耐受性、底物特异性广、合成反应较磷酸解反应速率快、以乒乓机制进行合成等优点,在纤维素的降解以及寡糖的合成方面具有很大的应用潜力。