铅是一种常见的职业与环境污染物，具有显著神经毒性作用，可造成学习记忆的损伤。迄今，铅损害学习记忆方面的研究虽然取得了一些进展，但具体机制仍不十分清楚，还有待进一步的研究。　　脑的高级神经活动是由相互作用的神经元-胶质细胞网络共同参与调控的。星形胶质细胞(Astrocyte，AS)是脑组织内数量最多和分布最广的神经胶质细胞，其对神经元的发育和迁移、突触的形成、递质传递的调节以及内、外环境的稳定等都起着十分重要的作用。脑组织超微结构显示，AS与毛细血管内皮细胞、基膜和周细胞等共同构成血-脑屏障，血液中的外来化学物质必须通过AS才能进入神经元。另外，研究发现AS是铅的“储藏池”。因此，我们有理由推测AS可能是铅在脑组织中初始损伤的靶细胞。　　研究显示，AS能够通过分泌胶质源性神经调质影响突触前膜神经递质的释放和突触后膜的受体反应，进而调节突触可塑性。如果AS是铅损伤的初始靶细胞，那么其功能异常能否引起突触形成及神经元信号转导的异常呢？　　综上所述，本实验以神经元-胶质细胞网络为研究主线，以原代培养的AS和神经元为试验对象，探讨AS内铅能否对突触形成与神经元内信息传递产生影响，为揭示铅损害学习记忆功能的机制提供新的研究方向和实验数据。　　方法：　　1、AS原代培养及ACM的制备　　取出生1～3天Wistar大鼠仔鼠，消毒后，断头取大脑皮质，剪碎、胰酶消化结合机械吹打使细胞分散，将细胞悬液接种在玻璃培养皿中，差速粘附处理去除成纤维细胞，将未粘附的细胞悬液接种在培养瓶中。GFAP染色鉴定细胞纯度。　　纯化AS形成单层，换成含铅浓度为0、50、100和200μmol/L的培养液，培养72 h。铅暴露后，弃培养液，换成含0和25μmol/L谷氨酸的细胞外液，作用10 min，弃去培养基，换成无血清培养液，继续培养6h，收集细胞培养液，离心过滤，制成AS条件培养液，保存备用。　　2、神经元的培养与纯化　　取新生Wistar大鼠仔鼠，分离大脑皮质，剪碎后胰酶消化，过滤，离心，加入含20％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，接种培养24 h。换Neurobasalmedium并加入阿糖胞苷，培养3d后半量换液，继续培养3d，特异性烯醇化酶染色鉴定细胞纯度。　　3、神经元分组与处理　　将原代培养的神经元随机分为纯培养组（原代培养神经元不加入ACM）、非Glu诱导的ACM处理组、Glu诱导（无铅暴露）ACM处理组和50、100和200μmol/L铅暴露的ACM处理组。加入ACM时弃去神经元纯培养体系中5/7的培养液，新加培养液由ACM和Neurobasal medium按3∶2构成。　　4、检测指标与方法　　(1) GFAP和NSE免疫荧光染色鉴定AS和神经元　　(2)倒置显微镜观察铅暴露AS细胞形态及生长状态并采集图像　　(3) AlamarBlue法检测细胞活力　　(4)倒置显微镜观察不同ACM处理的神经元细胞形态并采集图像　　(5) Western Blotting法检测神经元SYP蛋白表达　　(6)突触素免疫荧光双标细胞化学染色观察红色荧光颗粒数　　(7) Western Blot法检测NR1、NR2A、NR2B、CaMKⅡ和AC蛋白的表达　　5、统计分析　　实验数据采用SPSS17.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用q检验(SNK)。以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。　　结果：　　1、AS与神经元免疫荧光鉴定　　GFAP免疫荧光反应阳性细胞为AS，其胞浆呈红色;NSE免疫荧光反应阳性细胞为神经元，胞浆被染成绿色，经计数神经元纯度大于95％，可以进行下一步实验研究。　　2、铅暴露后AS形态观察　　50和100μmol/L铅暴露组AS形态与对照组相比未见明显改变，而200μmol/L铅暴露组的少量细胞开始脱壁，细胞间隙增大;随铅暴露浓度的增加，脱壁细胞数量明显增多，400μmol/L铅暴露组细胞变大，突起变短或消失。800μmol/L铅暴露组细胞大量脱壁，细胞数量明显减少。　　3、不同剂量铅暴露对AS活力的影响　　各铅暴露组细胞活力随染铅浓度的升高而下降，200μmol/L铅暴露组细胞活力为对照组的77％，800μmol/L铅暴露组细胞活力仅为对照组的一半。　　4、不同ACM处理后神经元形态观察　　培养5d后的神经元细胞5-10个聚集成团，周围突起清晰，均匀细长，突起之间相互交织成网。与纯培养组比较，无铅暴露ACM处理组的神经元集落间突起丰富，网络稠密;与无铅暴露ACM处理组比较，200μmol/L铅暴露ACM处理组的神经元突起连接相对稀疏，连接收到损伤。　　5、铅暴露AS的对神经元内SYP蛋白表达的影响　　与纯培养组相比，各时段的非Glu诱导的ACM处理组和Glu诱导的ACM处理组的神经元内SYP蛋白含量显著增加;与无铅暴露ACM处理组相比，培养72h的各铅暴露的ACM处理组的神经元内SYP蛋白含量随染铅剂量的升高而显著降低，培养48 h的200μmol/L铅暴露ACM处理组的神经元内SYP蛋白含量显著降低，培养24 h的各铅暴露的ACM处理组的神经元内SYP蛋白含量未见显著改变。　　6、突触素荧光染色观察突触形成　　突触素荧光标记物呈红色颗粒状，沿神经元胞体和突起排列，可清晰勾勒出神经元胞体和突起的轮廓，有的呈串珠状，在胞体部分有些可融合成块状。非Glu诱导的ACM处理组和Glu诱导的ACM处理组的SYP荧光颗粒数显著高于纯培养组。此外，非诱导的ACM处理组的SYP荧光颗粒数也显著高于Glu诱导的ACM处理组。各铅暴露的ACM处理组的SYP荧光颗粒数量与无铅暴露的ACM处理组比较显著降低，并随铅暴露剂量的升高而降低，差异有统计学意义。　　7、铅暴露ACM对神经元NMDA受体亚单位、CaMKⅡ、AC蛋白表达的影响　　与纯培养组相比，培养8h的非Glu诱导的ACM处理组的神经元内NR1蛋白表达显著增加，而Glu诱导的ACM处理组的神经元内NR1蛋白表达显著减少;与非Glu诱导的ACM处理组相比，培养4h和8h的Glu诱导的ACM处理组的神经元内NR1蛋白表达显著减少;与无铅暴露的ACM处理组相比，培养4h的200μmol/L铅暴露的ACM处理组、培养8h的100和200μmol/L铅暴露的ACM处理组及培养12h的各浓度铅暴露的ACM处理组的神经元内NR1蛋白含量显著减少。与纯培养组相比，非Glu诱导的ACM处理组及培养4h、12 hGlu诱导的ACM处理组NR2A蛋白表达显著增加，培养8 hGlu诱导的ACM处理组NR2A蛋白表达显著减少;与非Glu诱导的ACM处理组相比，各时段诱导无铅暴露ACM处理组NR2A蛋白表达显著减少;与无铅暴露ACM处理组相比，培养4h各剂量铅暴露ACM处理组神经元内NR2A蛋白表达没有差异;培养8h的200μmol/L铅暴露ACM处理组及12 h各铅暴露ACM处理培养组神经元内NR2A蛋白表达明显减少。与纯培养组相比，各时段非Glu诱导的ACM组和Glu诱导ACM处理组神经元内NR2B蛋白表达显著增高;与非Glu诱导的ACM处理组相比，Glu诱导ACM处理组NR2B蛋白表达4h显著增高，8h及12h显著减少;与无铅暴露ACM处理组相比，4h各剂量铅暴露ACM处理组神经元内NR2B蛋白显著增加;8h、12h铅暴露ACM处理组神经元内NR2B蛋白表达均为50、100μmol/L组显著增加，200μmol/L组显著减少。　　与纯培养组相比，各时段非Glu诱导的组和Glu诱导的ACM处理组神经元内CaMKⅡ蛋白表达显著增高;与非Glu诱导的ACM处理组相比，培养12 hGlu诱导的ACM处理组神经元内CaMKⅡ蛋白表达显著减少;与无铅暴露ACM处理组相比，培养4h的各剂量铅暴露ACM处理组神经元内CaMKⅡ蛋白表达没有差异;培养8h的200μmol/L铅暴露ACM处理组及12 h各剂量铅暴露ACM处理组神经元内CaMKⅡ蛋白表达显著减少。与纯培养组相比，各时段非Glu诱导的ACM处理组和Glu诱导ACM处理组神经元内AC蛋白表达显著增高;与非Glu诱导的ACM处理组相比，Glu诱导ACM处理组神经元内AC蛋白表达培养4h及12h显著增加;与无铅暴露ACM处理组相比，培养4h的100、200μmol/L铅暴露ACM处理组及培养8h、12h各剂量铅暴露ACM处理组神经元内AC蛋白表达明显减少。　　结论：　　1、铅暴露AS可间接抑制神经元间突触的形成。　　2、铅暴露AS对突触形成的抑制作用可能与其抑制神经元内NMDAR的亚单位表达，进而干扰CaMKⅡ和AC依赖的信号转导通路的信息传递。