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手性化合物的合成和拆分已成为药物化工的研究热点和关键技术。手性小分子羟基酸在其分子结构中含有羟基以及羧基这两个功能基团,是化学合成中非常有用的中间体,是一类非常重要的有机酸,在生物体内具有独特的生理功能,而在食品/饲料工业上又是一类非常有用的功能添加剂。这种情形与氨基酸十分相似,二者在一定条件下也可以相互转化；一些非天然的羟基酸,特别是具有光学活性的手性羟基酸,还可以作为“结构砌块”用于各种天然产物和药物分子的化学合成。而内酯化合物的生物拆分反应则是合成光学活性内酯或羟基酸的重要且实用的方法之一。
本实验室从土壤中筛选到一株内酯水解酶活性和选择性均较高的真菌菌株--镰孢霉菌Fusarium proliferatum(Matsushima)Nirenberg ECU2002,能够高对映选择性地催化水解(-)-α-羟基-γ-丁内酯和(-)-泛解酸内酯,且发酵条件简单,容易制备大量的生物催化剂。本文主要研究镰孢霉菌ECU2002左旋内酯水解酶的纯化过程,寻找合适的纯化方法,最终获得了纯化的酶,并利用半纯化酶研究了其生化性质和催化性能；研究了酶的底物谱,拓展了其应用范围；利用固定于棉织物上的内酯酶(酶布)为催化剂,构建了一个小型的固定床反应器,考察了反应器各种结构和操作参数对手性内酯催化水解反应的影响,确定了适宜的内酯酶重复利用方法,为酶在手性拆分中的扩大应用奠定了实验基础。
论文内容主要分为四个部分。在第一部分中,以γ-丁内酯系列化合物作为唯一碳源,通过富集培养从土壤中分离得到180株产内酯水解酶的菌株,经反复筛选,从中挑选出一株内酯水解活性和选择性均较高的菌株,经过德国菌种保藏中心DSMZ鉴定这株真菌为镰孢霉菌属,命名为为Fusarium proliferatum(Matsushima)Nirenberg ECU2002。
在第二部分中,对这株霉菌的产酶特性和摇瓶发酵产酶的优化条件进行了研究,结果表明,该镰孢霉菌的内酯酶同时存在于细胞内和细胞外发酵液中；培养基最佳组成为(L-1)：甘油30 g,蛋白胨10 g,酵母膏10 g,NaNO3 3 g,NaCl1 g,MgSO4·7H2O 1 g,FeSO4·7H2O 0.02 g,ZnSO4·7H2O 0.03 g,CuSO4·5H2O 0.005 g;优化后内酯水解酶的产量提高到4倍(由19 U/L增至75 U/L),在培养开始时添加泛醇可以促进酶的合成。摇瓶培养的最佳条件为：装液量12％(v/v),发酵起始pH 7.0,接种量2％(v/v),发酵温度30℃；考察了细胞生长及产酶的时间进程,发现培养的最佳时间为48 h。
在第三部分中,主要研究了镰孢霉菌ECU2002内酯酶的纯化过程,寻找到合适的纯化方法,获得了纯化的酶,并对半纯化酶进行了生化和催化性能表征；经高压匀浆、超滤、丙酮沉淀、两步DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、羟基磷灰石层析、Toyoscreen-Super Q和TSK-GEL凝胶层析共9步纯化,使该内酯酶的纯度提高了460倍,收率为9.7％；经SDS-PAGE和TSK-GEL凝胶层析,证实该酶的分子量为68 kD,为单倍体,二维电泳测得其等电点为5.7。确定最佳的酶反应pH和温度分别7.0～7.5和50℃。考察了不同化合物对酶活力的影响,发现β-环糊精对内酯酶而言是一种良好的保护剂；考察了不同底物对酶活力的影响,结果以α-羟基-γ-丁内酯为底物时酶的活力最高。利用戊二醛交联的内酯酶选择性催化水解四种手性丁内酯,包括β-丁内酯,α-羟基-γ-丁内酯,β-羟基-γ-丁内酯和α-羟基-β,β-二甲基-γ-丁内酯(泛内酯),分别得到四种光学纯度较高(94.8～98.2％ee)的手性羟基酸。利用戊二醛交联的左旋内酯水解酶催化(±)-泛解酸内酯的对映选择性水解,固定化酶重复使用10批后催化活力仍保持初始活力的67％,酶的半衰期大约为17个批次(102 h),水解的产物[D-(+)-泛解酸]经内酯化后得到的D-(-)-泛解酸内酯的光学纯度约为95％ee,经重结晶后光学纯度可达99％ee。
在第四部分中,以镰孢霉菌ECU2002内酯酶作为固定化和反应器构建的酶源,考察了共价结合和分子内交联等酶固定化方法,从中筛选出酶活回收率最高的棉布作为固定化的载体,并优化了固定化的条件：每0.2 g棉布加入10 ml酶液(含镰孢霉菌内酯酶4 mg/g棉,pH8.0),在30℃加入25 mM戊二醛交联固定化12 h,酶的活力回收率达55％。固定化酶布C具有优异的热稳定性,在30℃下酶活半衰期高达235 h。将α-羟基-γ-丁内酯(HBL)酶促水解与镰孢霉菌ECU2002的固定化酶布体系相耦联,构建了一个小型的固定床生物酶反应器。酶解反应器(φ1.5×12 cm)带有控温装置,利用铁丝网将固定化酶布卷折固定置于反应器内,通过蠕动泵以一定的循环速度使内酯反应液自下而上通过固定化酶布进行半连续反应。考察了内酯酶促水解过程中反应器的各种技术参数对反应初速度的影响,获得了优化的结果：反应体积50 mL时,将2 g固定化酶布C(20 U g-1)装柱,高度/直径(H/D)比为5,底物浓度为750 mM,反应温度为30℃,流速为20 mL min-1(SV=1min-1)。考察了固定床酶反应器中的反应动力学参数,测得镰孢霉菌固定化酶C的△H和△Ea分别为17.1 kJ.mol-1和34.2 kJ.mol-1。利用棉布固定化酶在工作体积50 ml的固定床反应器中对200 mM(±)-α-羟基-γ-丁内酯进行了60批次(每批反应2～3 h)的半连续拆分反应,经过近3周反复操作后,固定化酶布的活力仍保持初始活力的42.6％,水解产物羟基酸内酯化后所得(R)-α-羟基-γ-丁内酯的生产率为2.48 g L-1h-1,光学纯度为90.0～96.4％ee。