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研究背景自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder,ASD）,简称自闭症,核心症状为社交、语言障碍,重复呆板动作。ASD是一种复杂的神经发育障碍性疾病,其发病率在全球范围内迅速上升,社会负担巨大。ASD的病因尚不清楚,可能涉及遗传和环境因素的复杂相互作用,对ASD病理生理学的模糊认识阻碍了其有效治疗方法的发展。ASD患者肠道微生物群在生命发育早期具有不稳定和不成熟的特点,易受多种因素干扰导致生态失衡,这是造成ASD患者神经功能发育障碍的原因之一。由于肠道微生物群的成熟稳定与神经系统发育处于生命发育早期这一相同关键时间窗,在生命发育早期调控肠道微生物群有希望成为一种很有前途的ASD治疗策略。褪黑素是松果体产生释放的一种内源性激素,可以参与昼夜节律调控,同时褪黑素也是正常神经发育和胚胎生长所必须的。有临床研究证实,ASD患者伴随着体内褪黑素水平的下降。此外,胃肠道分泌产生了大部分松果体外褪黑素。多项研究证实,褪黑素可以参与修复多种疾病的肠道微生物群生态失衡,从而改善其症状。鉴于以上研究背景和研究基础,我们假设,生命早期补充褪黑素可以通过调控肠道微生物群挽救ASD社交缺陷。在本课题中,我们通过丙戊酸（valproicacid,VPA）诱导的子代自闭症小鼠模型,探讨了生命早期补充褪黑素对子代自闭症小鼠ASD相关社交行为和肠道微生物群的影响,发现了生命早期补充褪黑素通过调控肠道微生物群挽救子代VPA自闭症小鼠社交缺陷的新机制,为开发基于肠道微生物群的ASD治疗方法提供了生物学基础。研究目的1.探讨生命早期补充褪黑素能否挽救子代VPA自闭症小鼠社交缺陷。2.探讨生命早期补充褪黑素能否调控子代VPA自闭症小鼠肠道微生物群。3.探讨生命早期补充嗜黏蛋白阿克曼氏菌能否挽救VPA自闭症小鼠的社交缺陷以及其中枢机制。研究方法第一部分生命早期补充褪黑素挽救丙戊酸诱导的子代自闭症小鼠社交缺陷并修复上调其肠道微生物群阿克曼菌属丰度1.1动物模型构建及实验分组将受孕后的C57BL/6J雌鼠随机分成四组:一组在受孕第12.5天给予单次腹腔注射VPA溶液（600 mg/kg）,记为VPA组;一组在受孕后第12.5天给予单次腹腔注射和VPA溶液等体积的生理盐水,记为CTL组;一组在腹腔注射VPA溶液后,分娩第0天至分娩第21天喂养褪黑素,记为VPA+MELS组;一组在腹腔注射VPA溶液后同时开始喂养褪黑素,直至分娩第21天结束,记为VPA+MELL组。各组新生鼠分别取5～10只用于后续实验。1.2社交行为实验三厢社交实验、嗅觉社交实验。1.3肠道微生物菌群分析收集各组子代小鼠粪便,提取粪便DNA,以DNA为模板,对细菌16s rRNA基因V4可变区进行PCR扩增后测序,进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。第二部分嗜黏蛋白阿克曼氏菌对丙戊酸诱导的自闭症小鼠社交缺陷的挽救作用2.1动物模型构建及实验分组将受孕后的C57BL/6J雌鼠随机分成三组,在母鼠受孕第12.5天给予单次腹腔注射VPA溶液,子代小鼠经口灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila,A.muciniphila）,作为 VPA+Akk 组;VPA 组母鼠孕期注射VPA 溶液后,子代小鼠经口灌胃等体积甘油对照组母鼠孕期注射等体积生理盐水,子代小鼠经口灌胃等体积甘油。另取受孕后的C57BL/6J雌鼠随机分成三组:在子代小鼠P7至P21灌胃A muciniphila悬液后,尾静脉注射AAV-PHP.eb病毒,6周龄时腹腔注射氯氮平-N-氧化物（Clozapine-N-oxide,CNO）作为 Akk+CNO 组;Akk+Sal 组在其 6 周龄时腹腔注射等体积生理盐水;Veh+Sal组在子代小鼠P7至P21灌胃等体积生理盐水后,尾静脉注射AAV-PHP.eb病毒,6周龄时腹腔注射生理盐水。2.2社交行为实验三厢社交实验、嗅觉社交实验、单室社交互动实验、旷场实验、高架十字迷宫实验。2.3肠道微生物菌群分析收集各组子代小鼠粪便,提取粪便DNA,以DNA为模板,对细菌16s rRNA基因V4可变区进行PCR扩增后测序进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。2.4免疫组化社交行为后1.5h,经腹腔注射麻醉小鼠,心脏灌注后取大脑组织于4%多聚甲醛中固定,冰冻切片机切片,免疫组化检测多巴胺能神经元标志物TH和神经元活性标志物c-fos的表达及其共定位。2.5血清及盲肠代谢物分析收集血清及盲肠内容物,对其进行LC-MS代谢组学分析。研究结果第一部分生命早期补充褪黑素挽救子代自闭症小鼠社交缺陷并上调其肠道微生物群阿克曼菌属丰度1.1生命早期补充褪黑素能挽救子代VPA自闭症小鼠青春期时期社交缺陷6周龄三厢社交实验:CTL组子代小鼠与社交对象（S1）互动时间明显长于与空铁笼（E）的互动时间（P＜0.0001）,与新社交对象（S2）互动时间较旧社交对象（S1）显著延长（P＜0.01）。VPA组子代小鼠与S1和E的互动时间、与S1和S2的互动时间之间没有统计学差异（P＞0.05）。与VPA组子代小鼠相比,VPA+MELS组和VPA+MELL组子代小鼠与S1互动时间显著长于与E的互动时间（VPA+MELS:P＜0.0001;VPA+MELL:P＜0.0001）,与S2互动时间较与 S1 互动时间显著延长（VPA+MELS:P=0.0088;VPA+MELL:P=0.0001）;且VPA+MELL组子代小鼠社交偏好指数和社交新奇指数显著优于VPA组（社交偏好指数:P＜0.01,社交新奇指数:P＜0.05）。6周龄嗅觉社交实验:四组子代小鼠嗅探水、香草精气味的时间无统计学差异（P＞0.05）。VPA组子代小鼠嗅探陌生小鼠社交气味的时间较CTL组显著缩短（P＜0.01）;VPA+MELS组子代小鼠对陌生小鼠社交气味的嗅探时间较VPA组显著改善（P＜0.05）。1.2生命早期补充褪黑素能挽救子代VPA自闭症小鼠成年期社交缺陷8～10周龄三厢社交实验:CTL组子代小鼠与S1互动时间显著长于与E的互动时间（P=0.0001）,与S2互动时间显著长于与S1互动时间（P＜0.05）。VPA组子代小鼠与S1和E的互动时间、与S1和S2的互动时间之间没有统计学差异（P＞0.05）;与CTL组子代小鼠相比,VPA组社交偏好指数显著下降（P＜0.05）。VPA+MELS组和VPA+MELL组子代小鼠与S1互动时间显著长于与E 的互动时间（VPA+MELS:P=0.0001,VPA+MELL:P＜0.0001）,VPA+MELS组子代小鼠社交偏好指数较VPA组显著改善（P＜0.01）。1.3生命早期补充褪黑素修复子代VPA自闭症小鼠肠道微生物群生态失衡各组子代小鼠肠道微生物群α多样性分析显示:3周龄VPA组子代小鼠的肠道微生物群Chao指数较CTL组显著下降（P=0.014）;6周龄VPA组子代小鼠肠道微生物群的Chao指数和Shannon指数较CTL组显著升高（Chao:P＜0.001,Shannon:P＜0.01）。3周龄VPA+MELL组子代小鼠的肠道微生物群Chao指数和 Shannon 指数显著高于 VPA 组（Chao:P＜0.001,Shannon:P＜0.01）。CTL组、VPA组、VPA+MELS组和VPA+MELL组6周龄子代小鼠肠道微生物群Shannon指数与3周龄子代小鼠均无统计学差异（P＞0.05）。各组子代小鼠肠道微生物群β多样性分析显示:3周龄子代小鼠unWeighted UniFrac主坐标1（PC1,51.47%）将VPA组和其他三组显著分离出来,而CTL组、VPA+MELS组、VPA+MELL组基本重合;6周龄子代小鼠unWeighted UniFrac主坐标1（PC1,37.32%）同样将VPA组与其他三组显著分离出来,CTL组、VPA+MELS组、VPA+MELL组基本重合。不同实验组之间的共享和特异性OTUs分析显示,VPA组子代小鼠肠道微生物群唯一 OTUs数量最多。1.4生命早期补充褪黑素上调子代VPA自闭症小鼠肠道微生物阿克曼菌属丰度VPA+MELS组和VPA+MELL组3周龄子代小鼠肠道微生物群属水平阿克曼菌属（Akkermansia spp.）丰度较 VPA 组显著升高（VPA+MELS:P＜0.05,VPA+MELL:P＜0.01）。VPA+MELL组6周龄子代小鼠肠道微生物群属水平阿克曼菌属（Akkermansia spp.）丰度较VPA组显著升高（P＜0.01）。第二部分嗜黏蛋白阿克曼氏菌对丙戊酸诱导的自闭症小鼠社交缺陷的挽救作用2.1生命早期补充A.muciniphila挽救VPA自闭症小鼠社交缺陷三厢社交实验:CTL组子代小鼠与S1互动时间明显长于与E的互动时间（P＜0.0001）,与新社交对象（S2）互动时间较旧社交对象（S1）显著延长（P＜0.001）。VPA组子代小鼠与S1和E的互动时间、与S1和S2的互动时间之间没有统计学差异（P＞0.05）。与VPA组子代小鼠相比,VPA+Akk组子代小鼠与S1互动时间显著长于与E的互动时间（P＜0.0001）,与S2互动时间较与S1互动时间显著延长（P＜0.0001）;且VPA+Akk组子代小鼠社交偏好指数显著优于 VPA 组（P＜0.01）。嗅觉社交实验:三组子代小鼠对水、香草精气味的嗅探时间无统计学差异（P＞0.05）,但对陌生小鼠社交气味的嗅探时间显著不同（P=0.001）:VPA组子代小鼠对陌生小鼠社交气味的嗅探时间较CTL组显著缩短（P＜0.01）,VPA+Akk组子代小鼠对陌生小鼠社交气味的嗅探实验较VPA组显著延长（P＜0.001）。2.2生命早期补充A.muciniphila未改变VPA自闭症小鼠肠道微生物群多样性和群落结构VPA+Akk组和VPA组子代小鼠肠道微生物群α多样性分析Chao指数、Shannon指数之间不存在统计学差异（P＞0.05）;在对三组子代小鼠肠道微生物群β多样性分析unWeighted UniFrac PCoA分析二维排序图上,VPA组和VPA+Akk组基本重合。2.3生命早期补充A.muciniphila活化腹侧被盖区多巴胺能神经元VPA+Akk组子代小鼠VTA中c-fos+神经元总数较CTL组显著增加（P＜0.05）。VPA+Akk组子代小鼠VTA中活化的多巴胺能神经元（TH++c-fos+）占总活化神经元（c-fos+）的比例较VPA组显著增高（P＜0.05）。2.4沉默腹侧被盖区多巴胺能神经元活性部分阻断A.muciniphila对社交行为的促进作用单室社交互动实验:三组小鼠在探索装有空铁笼厢体时所花费的时间不存在统计学差异（P＞0.05）。Akk+Sal组小鼠探索装有社交对象厢体时所花费的时间较其他两组虽无明显统计学差异,但呈现出上升趋势;同时,Akk+Sal组小鼠的社交偏好指数交Veh+Sal组显著提高（P＜0.05）。Akk+CNO组小鼠的社交偏好指数较Veh+Sal组小鼠无统计学差异（P＞0.05）。在旷场实验中,各组小鼠在总活动距离上没有统计学差异（P＞0.05）,各组子代小鼠在旷场中心位置的停留时间没有统计学差异（P＞0.05）。在高架十字迷宫实验中,各组小鼠前往开放臂的次数、在开放臂和闭合臂的总次数以及在开放臂中花费的时间均无统计学差异（P＞0.05）。2.5生命早期补充A.muciniphila调节VPA自闭症小鼠盲肠及血清代谢物小鼠盲肠内容物和血清中,VPA+Akk组与VPA组之间有多种代谢物水平存在显著差异。与VPA组相比,VPA+Akk组盲肠内容物和血清中牛磺酸水平均显著增加（盲肠内容物:P＜0.01,血清:P＜0.05）。研究结论1.生命早期补充褪黑素可以改善子代VPA自闭症小鼠社交意愿和社交新奇感,挽救其社交缺陷。2.生命早期补充褪黑素可以修复子代VPA自闭症小鼠肠道微生物群生态失衡,稳定其多样性和群落结构,显著上调阿克曼菌属（Akkermansiaspp.）丰度。3.生命早期补充A.muciniphila可以挽救自闭症小鼠社交缺陷。A.muciniphila对社交行为的促进作用是通过VTA多巴胺能神经元介导的。4.盲肠和血清代谢物可能参与了 A.muciniphila和社交行为之间的肠-脑轴调控机制。