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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,随着人们平均寿命的提高,生存环境及生活方式的改变,近年来CRC的发病率呈现逐年上升的趋势,在发达国家及我国经济发达地区,CRC的发病率已上升至恶性肿瘤的第二位。全球每年新增病例约一百万,约五十万患者因其死亡,CRC已经成为全球恶性肿瘤导致死亡的主要原因之一。随着对CRC病因学的深入研究,人们发现CRC的发生是多阶段、多因素累积作用的结果,其中基因突变和分子信号传导通路的异常激活和CRC的形成及发展密切相关。研究表明,表皮生长因子受体(EGFR)所介导的级联通路的活化是CRC发生、浸袭和转移的主要危险因素之一。EGFR是一种跨膜的酪氨酸激酶受体,在多种实体瘤中均有表达,EGFR与配体结合活化激活的下游信号传导通路主要有两条:一条是RAS/RAF/MAPK,另一条是PI3K/AKT。在过去的十年中,针对EGFR的靶向治疗显著地改善了晚期CRC患者的治疗效果,开创了靶向治疗的新时代。西妥昔单抗(Cetuximab, Erbitux, C225,爱必妥)做为抗EGFR单克隆抗体的代表性药物,在复发、转移的晚期CRC患者的一线及二线治疗中均显示了较好的疗效。随着靶向治疗发展,广大学者发现C225仅适用于KRAS野生型的CRC患者,KRAS基因的突变状态已经成为预测单抗疗效的重要生物学标志物。但在实际的临床应用中,仍有部分KRAS野生型的CRC患者C225治疗无效,一定存在其它影响单抗疗效的生物学因素。现有的研究虽表明了基因突变在CRC中的作用,但关于基因突变与CRC患者临床病理指标之间关系的报道却较少,并且除KRAS外现仍无公认的生物学标志物来预测C225的疗效,所以仍需进一步的实验研究来探讨基因突变在CRC中的生物学意义,并迫切的需要发现新的生物学标志来预测单抗的疗效,推动CRC分子靶向治疗的发展。本课题收集我院2008-2009年入院治疗的200例CRC患者的癌组织标本,以CRC中EGFR信号传导通路为靶点,联合检测并分析KRAS、BRAF和PIK3CA突变与临床病理指标之间的关系,探讨基因突变在CRC发生、发展中的生物学意义,为肿瘤的诊断、判断生物学行为及预后提供更可靠的依据。另外收集我院行C225治疗的CRC患者的临床资料及癌组织标本,联合检测KRAS、BRAF、PIK3CA突变和PTEN的表达,并对每一例患者进行疗效评估及严格随访,根据检测、评估及随访的结果,期望能发现新的生物学标记物来预测C225疗效,为临床的应用提供指导,具有一定的临床意义。在本研究中,我们分别从200例癌组织石蜡标本中提取DNA,行PCR扩增后采用焦磷酸测序技术,检测KRAS、BRAF和PIK3CA的突变率,统计分析基因突变与临床病理之间的关系(包括:患者的年龄、性别、肿瘤位置、Dukes’分期、TNM分期、组织病理学分型及转移)。研究发现焦磷酸测序技术是一种切实可靠的测序技术,其灵敏程度要远远高于其它测序方法。在200例患者中KRAS突变率为31.5%(63/200),其中12密码子突变率为26%(52/200),13密码子突变率为5%(10/200),12和13密码子双突变率为0.5%(1/200)。BRAF突变率为7%(14/200),PIK3CA突变突变率为12.5%(25/200),其中9号外显子突变率为6%(12/200),20号外显子突变率为6.5%(13/200),结果表明中西方人群中,CRC患者的KRAS、BRAF和PIK3CA的突变率无明显差别,KRAS和BRAF的突变是相互排斥的、在同一患者中不可同时存在,而KRAS和PIK3CA的突变却可以同时发生。此外结合患者的临床资料,我们发现KRAS、BRAF和PIK3CA的突变与CRC患者的年龄、性别、肿瘤位置、组织病理学分型之间无明显的关系。然而KRAS和PIK3CA的突变与患者的Dukes’分期之间的关系密切,相比之下,BRAF的突变和Dukes’分期无明显的关联。PIK3CA的突变好发生于Dukes’D期的KRAS突变型的CRC患者,说明KRAS和PIK3CA双突变和CRC的远处转移,尤其是和肝脏转移密切相关。KRAS和PIK3CA的突变可能成为判断CRC患者转归和预后的生物学标志物。此外我们对C225治疗的KRAS野生型CRC患者进行疗效评估及随访,并检测了每例患者BRAF、PIK3CA基因的突变,并采用免疫组织化学染色检测PTEN在癌及癌旁组织中的表达情况。结果表明PTEN主要表达在细胞核内,在癌组织中表达降低或缺失,在正常组织中表达正常,并且PTEN的表达和西妥昔单抗的疗效密切相关,在我们的研究中PTEN表达阳性及阴性患者的反应率(CR+PR)分别为(42.9%,36.4%,P<0.05),说明PTEN表达缺失患者的疗效较差,PTEN可能成为单抗疗效的预测因子。此外实验结果表明:KRAS、BRAF及PIK3CA基因均为野生型的患者对单抗治疗的反应率为62.5%(CR+PR),而存在BRAF及PIK3CA突变患者的反应率分别为(0%, 28.6%),证实了BRAF及PIK3CA的突变可显著影响C225的疗效,BRAF、PIK3CA和PTEN可做为C225疗效的预测因子。总结上述结果,我们可以得出下列结论:KRAS和PIK3CA基因的双突变与CRC的远处转移密切相关,KRAS和PIK3CA的突变可能成为判断CRC患者转归和预后的生物学标志物,此外BRAF、PIK3CA的突变和PTEN的表达缺失可以显著影响C225的疗效。对上述结论的深入研究,可以使我们更加深刻地认识到基因突变在CRC中的生物学意义,帮助临床医生对每位患者的转归及预后做出正确的判断,并推动以靶向治疗为基础的CRC个体化治疗的进程,具有深远的临床意义。