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具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白是慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发生和发展的关键因素。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)作为治疗CML的临床一线药物,能有效抑制BCR-ABL蛋白激酶活性,但无法彻底清除CML细胞内 BCR-ABL融合蛋白。本课题设想以 BCR-ABL蛋白的磷酸化Y177位点为靶点,利用与其特异性结合的SH2结构域,在CML细胞株 K562细胞中同时表达融合 SH2和鸟氨酸脱羧酶(ODC)片段的SH2-ODC(SO)融合蛋白和抗酶蛋白1(AZ1),引导 BCR-ABL蛋白进入鸟氨酸脱羧酶降解途径,以达到抑制K562细胞增殖,促进K562细胞凋亡的目的。 本课题通过构建携带目的基因的重组腺病毒 Ad-SH2-ODC(简称Ad-SO)、突变型 Ad-Sm-ODC(简称 Ad-SmO)和 Ad-AZ1,检测目的蛋白SO、SmO和AZ1在K562细胞中的表达及亚细胞定位情况。Ad-SO(或Ad-SmO)与Ad-AZ1共感染K562细胞,检测BCR-ABL蛋白表达水平及其引起的细胞增殖和凋亡效应的改变。主要实验方法如下: (1)重组腺病毒Ad-SO、Ad-SmO和Ad-AZ1的构建和鉴定:将目的基因SH2、Sm、ODC和AZ1分别连入T载体后,克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV,制备成穿梭质粒 pAdTrack-CMV-SO、pAdTrack-CMV-SmO和 pAdTrack-CMV-AZ1。双酶切和测序验证后,与腺病毒骨架质粒pAdEasier同源重组,构建成腺病毒质粒。在AD293细胞中包装、扩增,获得腺病毒Ad-SO、Ad-SmO和Ad-AZ1。同时扩增空载病毒Ad-NL。腺病毒分别感染K562细胞,western blot检测目的蛋白SO、SmO和AZ1的表达情况。 (2)SH2-ODC/AZ1降解BCR-ABL蛋白的效应:免疫荧光技术分别检测目的蛋白SO(或SmO)和AZ1在K562细胞中的表达及其在胞浆中与BCR-ABL蛋白的共定位情况。腺病毒Ad-SO(或Ad-SmO)与Ad-AZ1共感染K562细胞,以空载病毒Ad-NL为对照,western blot检测K562细胞中BCR-ABL蛋白表达水平的改变。 (3)SH2-ODC/AZ1对K562细胞增殖和凋亡的影响:腺病毒Ad-SO(或Ad-SmO)与Ad-AZ1共感染K562细胞, MTT实验和克隆形成实验检测K562细胞增殖能力的改变,通过瑞氏染色和Magic Red试剂盒法检测caspase3/7的活化水平,观察K562细胞凋亡的发生。 通过以上实验,得出如下结果及结论: (1)成功构建了携带目的基因的重组腺病毒质粒 pAd-SO、pAd-SmO和pAd5-AZ1,在AD293细胞中包装、扩增出高滴度的腺病毒 Ad-SO、 Ad-SmO、Ad-AZ1和空载对照腺病毒 Ad-NL。腺病毒Ad-SO、 Ad-SmO能在 K562细胞中表达带有 HA标签的目的蛋白, Ad-AZ1能表达带有FLAG标签的AZ1蛋白。 (2)重组腺病毒Ad-SO、 Ad-SmO和Ad-AZ1在K562细胞中表达的目的蛋白与 BCR-ABL蛋白共定位于细胞浆。western blot证实Ad-SO和Ad-AZ1共感染K562细胞72h后,BCR-ABL蛋白表达水平较突变对照组和空载对照组降低。 (3)MTT实验和克隆形成实验证实共表达 SO和 AZ1能够抑制K562细胞的增殖能力和克隆形成能力。瑞氏染色和caspase3/7活化水平检测证实, SO/AZ1系统可以诱导K562细胞发生凋亡。 综上所述,本课题借助腺病毒表达体系,在K562细胞中表达融合蛋白SO和AZ1,利用SO蛋白一端的SH2段特异性结合BCR-ABL蛋白,另一端的ODC蛋白在AZ1的协助下,引导BCR-ABL蛋白进入鸟氨酸脱羧酶降解途径,达到靶向降解胞内的BCR-ABL蛋白,抑制K562细胞增殖能力,诱导K562细胞发生凋亡的目的。