软骨组织在人体关节中的主要作用是润滑和防止磨损,但是由于长期的关节磨损或者关节疾病可能引起软骨组织病变,将会导致关节炎的发生。关节炎是人类最常见的慢性疾病之一,也是全球范围内发病率较高的疾病,关节炎患者常常会伴随着关节疼痛、肿胀、僵硬等症状,关节炎最终可能导致患者行动不便甚至瘫痪,严重影响患者的生活质量。基于此研究背景,本论文利用微流控技术以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)为原料,利用明胶(Gelatin,Gel)为致孔剂,制备了PLGA大多孔高分子微球支架,并分别通过与软骨细胞和成骨细胞/内皮细胞共培养体外构建软骨球状微组织以及成骨-内皮球状微组织,两种复合球状微组织再分别复合水凝胶加以固定构建出上层为软骨组织下层为成骨/内皮组织的关节单元模型,然后用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导发生病变构建关节炎模型,最后用于关节炎药物筛选的研究。首先,利用微流控技术制备PLGA大多孔微球支架并进行表征。用聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)管道设计搭建T型微通道,并配制浓度为2%的PLGA溶液和浓度为6%的Gel溶液,以及浓度为2%的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)溶液。利用微流控液滴剪切原理得到大多孔微球,制备得到的大多孔微球粒径分布在350μm-700μm之间,孔径分布10μm-60μm之间,粒径均一,孔径较大,形貌较好。通过傅里叶红外光谱、X射线衍射和热重分析后表明,与原材料相比,大多孔高分子微球官能团、晶型、玻璃化转变温度均未发生明显改变。通过体外降解实验降解6周后体外降解失重率达到90%以下,说明微球支架在体外具有较好的降解性。其次,将细胞与微球支架共培养,并在体外构建球状微组织并对其进行生物学研究。首先考察微球支架悬液对细胞生长的影响,结果表明微球支架不会影响细胞的形貌,也不会影响细胞的增殖生长。然后考察细胞在大多孔微球支架上的增殖、黏附以及生长状况,实验结果表明随着共培养时间的延长,细胞在微球支架上不断生长增殖,且生长状况良好,并且采用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)观察静态培养和动态培养后细胞在微球支架上的分布,比较结果发现动态培养更有利于细胞在大多孔微球支架上生长增殖,动态培养7天后发现细胞基本可以长满于大多孔微球支架上且细胞可以延伸生长到支架内部。并通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色和蛋白免疫组化染色表明体外构建的微组织可以表达软骨特异性蛋白,说明微组织初步构建成功。综上所述可以用动态共培养的方式在体外构建软骨球状微组织和成骨球状微组织。接着,在体外构建关节炎模型并对其进行生物学研究。利用水凝胶对体外构建的微组织进行固定,从扫描电镜图中可以看出水凝胶具有孔洞结构有利于营养物质、代谢废物以及气体的交换。水凝胶分别与体外构建的微组织混合后,可以通过蓝光照射固化交联构建出下层为成骨细胞/内皮细胞的球状微组织,上层为软骨细胞的球状微组织结构。构建该组织结构可以模拟关节模型,然后通过LPS诱导发生病变,构建关节炎模型。通过CCK-8法考察不同浓度LPS对细胞活性的影响,实验结果表明LPS浓度为1μg/mL时,几乎不会对细胞活性有影响,当LPS浓度为10μg/mL时,对细胞活性具有较小的影响。考察不同浓度LPS对构建出的微组织作用不同时间段后,用试剂盒考察测定微组织上清液中白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)以及肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量,实验结果表明,用浓度为0.5μg/mL的LPS作用48 h后,微组织上清液中IL-1β和TNF-α的含量最高。故选择脂多糖导致发生关节病变的最佳浓度为0.5μg/mL,最佳作用时间为48 h。最后,研究姜黄素对构建的关节炎模型上清液中IL-1β和TNF-α的含量影响。采用CCK-8法检测不同浓度的姜黄素对细胞的毒性,细胞毒性结果表明用浓度为10μg/mL的姜黄素对细胞作用48 h,从细胞形貌的变化和细胞的相对增殖率上可以看出10μg/mL的姜黄素对细胞已经具有毒性。当姜黄素浓度为8μg/mL时,既不会改变细胞形貌也不会影响细胞的生长。所以采用8μg/mL的姜黄素作为最佳给药浓度。采用CLSM观察8μg/mL的姜黄素对关节模型预处理4 h后,姜黄素被细胞吞噬。试剂盒检测结果表明:姜黄素预处理后可降低LPS诱导的关节炎模型组织IL-1β、TNF-α炎症因子水平,抑制促炎因子的释放是对关节软骨的一种保护机制,也进一步证明本文中构建的关节单元模型可以用于药物筛选的研究。综上所述,基于微流控技术可成功制备PLGA大多孔微球,在体外具有可降解性;大多孔微球具有良好的生物相容性,C518细胞和MC3T3-E1细胞可以在大多孔微球支架上黏附、生长和增殖,可构建出成骨球状微组织和软骨球状微组织;复合水凝胶固化后可以构建出下层为成骨/内皮细胞组织,上层为软骨组织的关节模型,并且利用LPS诱导该模型构建出关节炎模型用于姜黄素筛选的研究。本课题有望为构建新型的关节炎药物筛选模型提供一个潜在的可行方案。