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菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是我国十大传统名花和世界四大鲜切花之一,其栽培面积和产量在各花卉中均居于前列。氮素营养水平通常会影响菊花的产量和品质。硝态氮(NO3--N)是菊花吸收氮素的主要形式。根系吸收的NO3-经过木质部导管长途转运后主要存储在叶片液泡中,并能在氮源不足时将储存在液泡中的N03-释放出来供菊花再分配和再利用。因此,了解N03-在菊花叶片液泡中的储存机制对培育氮高效利用率和氮饥饿耐受性高的菊花新品种至关重要。近年来的研究发现定位于液泡膜上的CLC家族的一些基因可能参与植物液泡N03-的存储。但在菊花中关于这一方面的报道还比较少。本研究以菊花扦插生根苗‘神马’为试材,外源N03-水培条件下筛选出液泡NO3-响应基因CnCLCa并对其进行功能验证。主要研究内容及结果:1、外源NO3-能诱导菊花CmCLCa的表达用含有5 mM KN03的Hoagland营养液水培处理(对照为不含N元素的Hoagland营养液)后,分别在第0、1、4、8、12、16、20和24 h对液泡NO3-存储相关基因CmCLCa-c、CmCLCg进行实时荧光定量PCR,并测定了菊花叶片液泡中NO3-含量。结果显示,CmCLCa的表达水平受到外源N03-的诱导而明显上调,与叶片液泡中N03-含量变化趋势一致。初步判定CmCLCa可能参与菊花液泡NO3-的存储。2、CmCLCa-RNAi转基因菊花叶片液泡NO3-含量显著降低为了进一步验证CmCLCa的功能,我们运用RNAi技术,获得了 CmCLCa-RNAi转基因菊花植株。在含有5 mM KN03的Hoagland营养液水培处理0和24 h后分别测定野生型(WT)和CmCLCa-RNAi转基因菊花叶片液泡中NO3-含量。我们发现,同WT植株相比,CmCLCa-RNAi转基因菊花中液泡N03-含量显著降低。这表明,菊花CmCLCa与叶片液泡中N03-的存储密切相关。3、CmCLCa-RNAi转基因菊花叶片液泡膜质子泵活性降低在含有5 mM KN03的Hoagland营养液水培处理0和24 h后,我们还测定WT和CmCLCa-RNAi转基因菊花叶片液泡膜质子泵(V-ATPase和V-PPase)的活性。结果表明,同WT植株相比,CmCLCa-RNAi转基因菊花中V-ATPase和V-PPase的活性也明显下降。4、CmCLCa-RNAi转基因菊花根系NO3-转运蛋白相关基因的表达量降低为了研究沉默CmCLCa基因是否影响菊花根系N03-转运蛋白相关基因的表达,在含5 mM KN03的Hoagland营养液水培培养下,我们测定了两个根系N03-转运蛋白相关基因(CmNRT2.1和CmNRT2.4)在WT和CmCLCa-RNAi转基因菊花中表达量的变化。结果显示,在处理第4h,同WT植株相比,CmCLCa-RNAi转基因菊花根系中CmNRT2.1和CmNRT 2.4基因表达量均下降。这表明,同WT植株相比,CmCLCa-RNAi转基因菊花根系对外源N03-的转运能力下降。5、CmCLCa-RNAi转基因菊花地上部分的生长发育受到抑制为了探究沉默CmCLCa对菊花地上部生长发育的影响,我们还对CmCLCa-RNAi转基因菊花进行了长期观察。结果发现,在含5 mM KN03的Hoagland营养液中水培处理28 d的CmCLCa-RNAi转基因菊花的叶片光合能力和叶绿素含量均显著低于WT植株,且CmCLCa-RNAi转基因菊花叶片的各形态指标也明显低于WT植株。这表明,沉默CmCLCa能够抑制菊花地上部的生长发育。6、CmCLCa-RNAi转基因菊花对氮饥饿的耐受性降低为了验证沉默CmCLCa对菊花氮饥饿耐受性的影响,我们将在含5 mM KNO3的Hoagland营养液中水培处理28 d的WT和CmCLCa-RNAi转基因菊花植株同时转移到无N的Hoagland营养液中进行氮饥饿处理7 d。结果发现,CmCLCa-RNAi转基因菊花对氮饥饿处理更为敏感。主要表现为:随着氮饥饿处理时间的延长,CmCLCa-RNAi转基因菊花液泡中N03-含量骤降地更早,长势也更差。以上结论表明,抑制CmCLCa基因的表达能使菊花液泡中N03-存储量降低和对氮饥饿的耐受性减弱。这突出了CmCLCa作为目标候选基因在培育氮高效利用率和氮饥饿耐受性高的菊花新品种中的潜力。