基于ARTP选育地衣芽孢杆菌胞外聚合物高产菌株及其代谢机制解析

来源 :王海燕 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jyzhenghb
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胞外聚合物由于兼具吸附、絮凝和保水能力,并且安全无毒、环保可降解,因此已被广泛应用于食品、化妆品、农业、医药和污水处理等领域。本课题以实验室自主筛选的胞外聚合物生产菌株Bacillus licheniformis CGMCC 2876为研究对象,利用ARTP诱变技术获取了高产菌株,进而研究了菌株诱变前后胞外聚合物代谢途径变化,并提出了胞外聚合物合成工艺优化策略。首先,采用ARTP诱变技术处理并筛选获得一株胞外聚合物高产菌株Bacillus licheniformis M32,其遗传性能稳定。诱变菌株的胞外聚合物粗提产量达13.6g/L,较原始菌株提高了 35%。其中,γ-PGA的产量为6.68 g/L,较原始菌株提高了 11%。胞外聚合物中多糖和蛋白的含量未发生显著变化。原始菌株和诱变菌株所产的胞外聚合物分子量均分布在6.69-8.57×107Da左右,无明显差异,诱变后菌株的胞外聚合物中含有较多高分子量物质。其次,通过基因重测序研究了诱变后菌株基因信息,并采用分子对接手段探索提高γ-PGA产量的分子机制。诱变菌株Bacillus licheniformis M32的基因组中共检测到54个单核苷酸变异(SNPs)及7个插入/缺失(InDels)变异。其中,在诱变菌株中编码脂肽Plipastatin合酶亚基C(PpsC)的基因ppsC检测到了 5个非同义SNPs。通过模拟分子对接发现,变异后PpsC与谷氨酸的结合位点增多、结合能增强,与缬氨酸、丙氨酸的结合位点减少,结合能降低,这一变化可能促进了谷氨酸的激活与聚合,进而促进γ-PGA合成通路代谢通量。利用代谢组学和qRT-PCR分析了菌株代谢通量的分布情况。针对γ-PGA合成途径:诱变菌株中capB、capC、capA上调,导致γ-PGA产量提高;胞内代谢物丙氨酸因与PpsC结合能力的下降出现了积累从而刺激了 TCA循环,利于谷氨酸的合成;同时丙氨酸的上调促进了 L-谷氨酸和D-谷氨酸的相互转化,加强了谷氨酸合成致使γ-PGA的产量上调。针对糖酵解途径:诱变菌株中,crr,pyk,pdh,pgi,glpk显著上调,表明菌株能更好地利用葡萄糖;同时糖酵解代谢途径上调可能为菌体提供了更多的能量。丝氨酸上调引起的丙酮酸激酶活性变化,可能是导致糖酵解途径上调的原因。针对多糖代谢途径:诱变菌株多糖代谢途径上的基因和代谢物上调,但产量未发生明显变化。对地衣芽孢杆菌胞外聚合物合成工艺进行了优化,添加谷氨酸钠、葡萄糖、NaNO3显著提高胞外聚合物产量,胞外聚合物产量最高达47.54 g/L,较原始菌株高17.44%,其中γ-PGA产量为28.43 g/L。
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