云南位于中国西南边陲,毗邻世界著名毒品产地金三角地区,是毒品进入中国的重要通道,也是HIV-1进入中国的门户。我国现在流行的主要HIV-1毒株大都首先传入云南或在云南形成,然后经吸毒或性传播人群传入广西、四川和新疆以及其他地区,最终导致全国范围的流行。因此,云南被认为是我国HIV-1流行的中心,其HIV-1毒株流行的特征影响全国HIV-1毒株变异和进化。大量研究显示,云南HIV-1流行有明显的地区和人群差异,且流行病毒株处于不断地变化之中,迫切需要对该地区不断进行HIV-1流行的分子流行病学研究。在本研究中,我们以云南省艾滋病关爱中心2013-2015年收治的773例HIV-1感染者和艾滋病患者为研究对象,获得其人口统计学信息,扩增、测定其体内HIV-1主要结构基因序列,分析病毒亚型和系统进化关系,推测病毒耐药信息,检测HCV协同感染状况,针对特定研究对象扩增测定近似全长基因,全面系统地了解云南HIV-1毒株的变异和流行特征,为云南乃至全国的HIV-1防控提供基础信息。目的:(1)了解云南省流行HIV-1毒株的亚型分布、表型特点及变异特征;(2)确定云南省HIV-1耐药毒株的类型、分布和传播状况,为云南省艾滋病的抗病毒治疗提供信息;(3)基于长片段基因序列和近似全长HIV-1基因序列,了解和掌握云南省HIV-1毒株的重组特点和各个基因的进化特征;(4)分析云南省HIV-1感染者中HCV协同感染情况及HCV亚型分布情况。方法:以云南省艾滋病关爱中心2013年7月到2015年7月收治的所有(773例)HIV-1感染者为研究对象,收集背景信息,采集外周血样本,测定CD4细胞计数后分离血浆和淋巴细胞富集液,进行以下研究:(1)提取病毒RNA,利用逆转录巢式-PCR的方法扩增、测定gag、pol、env及部分样本3’半分子基因。序列经拼接、校对后,提交在线HIV-1序列数据库,利用在线软件进行质量控制。使用网络分型软件REGA、jp HMM、RIP、NCBI确定HIV-1亚型或重组基因型。(2)将获得的序列与HIV-1各亚型标准参考序列比对后,利用Mega6.06软件,选择Kimura 2-parameter model模型,构建系统进化树,将系统进化树结果与分型软件结果相互印证。应用Phy ML3.0选择GTR+I+G碱基替代模型构建ML树,进一步确定流行簇,分析不同毒株系统进化关系。利用BEAST软件中Markov Chains Monte Carlo进化分析方法构建MCC树,分析重要毒株不同流行簇起源时间,预测有效感染人数。(3)使用geno2pheno、PSSM软件,根据env区V3环序列分析病毒嗜性,比较不同亚型病毒嗜性差异。(4)将pol区序列提交到美国斯坦福大学耐药数据库进行耐药预测。(5)利用酶联免疫法检测300例即将开始抗病毒治疗艾滋病患者血浆标本的HCV抗体,对检出的HCV抗体阳性样本,采用逆转录巢式-PCR的方法扩增、测定HCV的NCR/C、C/E2和NS5B基因片段,使用COMET软件和系统进化树的方法确定HCV亚型,分析HIV-1感染者中HCV协同感染状况。结果:(1)773例HIV-1感染者和艾滋病患者中,473例为抗病毒治疗失败的患者、300例为即将开始抗病毒治疗的患者,来自云南省13个州(市),德宏、临沧、红河、昆明四个地区的病例最多,均超过整体的10%;感染者来自多个民族,以汉族为主(76.1%);感染途径以异性性传播为主(73.0%)。(2)获得gag区全长基因596条(扩增阳性率77.1%)、pol区基因序列586条(扩增阳性率75.8%)、env区基因658条(扩增阳性率85.1%),拼接获得gag-pol基因序列526条(68.0%),近似全长序列50条。(3)获得了613份样本的HIV-1亚型结果,鉴定出12个HIV-1亚型,主要流行亚型依次为CRF08_BC(53.4%)、CRF01_AE(19.4%)、新型重组毒株URF(12.7%)和CRF07_BC(9.0%)。系统进化树分型结果显示,相同亚型的HIV-1序列在进化树上聚集成簇,URF序列在进化树上分布于各亚型参考序列之间。50条HIV-1近似全长基因组序列包括30条CRF08_BC、4条CRF07_BC、9条CRF01_AE和7条URF。(4)对全国CRF07_BC亚型序列的分析发现,CRF07_BC已经传入了MSM人群,导致这个毒株在我国的第二波快速增长。(5)对658株病毒进行了辅助受体嗜性预测,其中R5嗜性555株、R5/X4嗜性21株、X4嗜性82株,所有亚型病毒均以R5嗜性为主,X4嗜性病毒在不同亚型中的分布存在差异,CRF01_AE毒株X4嗜性的比例明显高于其他亚型(P=0.000)。(6)未治疗的HIV-1感染者耐药率为1.5%,抗病毒治疗失败的感染者耐药率为38.7%,主要耐药位点为M184V/I和103N/S。(8)HIV-1感染者中HCV抗体的阳性率为20.67%。HCV基因扩增测序获得NCR序列54条,CE/2序列53条和NS5B序列53条。获得55例HIV-1感染者体内协同感染的HCV亚型结果,包括3个基因型7个基因亚型,依次为3b(45.5%)、6n(16.3%)、1a(10.9%)、3a(10.9%)、1b(9.1%)、6v(5.5%)、6u(1.8%)。结论:(1)云南省HIV-1毒株高度变异、分布复杂,在以CRF08_BC占优势的同时,有11种基因亚型的毒株流行,还有10%以上的新型重组毒株(URF),民族、传播途径及不同地区均显示毒株亚型分布的差异,提示云南省仍然是我国新型HIV毒株的主要来源,需要密切监测。(2)新型重组毒株的重组模式主要有B/C重组和CRF01_AE的参与的重组,前者主要出现在IDU人群,后者多见于性传播人群。德宏URF毒株的比例高达34.7%,是重组的热点地区和新型流行毒株的起源地。(3)CRF07_BC毒株虽然在云南地区流行率不高,但已经进入到MSM人群,是这个毒株第二波流行的驱动因素,需要加强监测。(4)云南未治疗人群中耐药毒株的流行较低,但抗病毒治疗失败的人群中耐药流行率较高,应该在开始治疗前检测病毒耐药性,保证治疗效果;耐药位点以M184V/I和103N/S为主,在后续的临床治疗中应考虑使用敏感的二线药物。(5)云南HIV-1感染者中HCV协同感染率高,流行亚型复杂,可能会影响本地的HIV-1感染者疾病进程及治疗效果,需要进一步监测。