1研究背景和目的世界范围内,食管癌死亡人数位居恶性肿瘤第六位;在我国,食管癌是第四位癌症死亡原因;我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家,全世界每年一半以上的新发和死亡患者均发生在中国。食管癌预后较差,5年生存率仅20%左右。虽然各种治疗方式进展迅速,但食管癌生存率多年来一直处于较低水平。早期食管癌预后很好,但临床上90%以上患者确诊时已是中晚期。中晚期食管癌生存状况普遍较差,但仍有部分患者可以长期生存十年以上,有些可达三十年以上。如何找出影响患者生存期的原因、提高患者生存率是每位癌症研究工作者的使命,也是众多研究者关注的焦点问题之一。本研究在大样本量流行病学调查的基础之上进行大规模生存期随访,试图通过生存分析找出生存期的影响因素,为临床食管癌防治提供坚实的科学依据。食管癌极强的地域性分布差异和显著的家族聚集现象提示环境和遗传因素均在其发病机制中起重要作用。有研究提示免疫防御机制在食管癌变过程中可能起到重要的作用;而人类的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）是与自身免疫密切相关的重要区域;本研究组前期的中国人食管鳞癌全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）共计发现了10个食管鳞癌易感单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点和8个相关易感基因;本研究组前期揭示了3个MHC区域的SNP和食管鳞癌相关,但未进行另外独立样本的验证。本研究是在前期基础之上,为了评估免疫因素对食管癌发病的影响,进一步扩大了样本量,进行了MHC区域的食管癌GWAS研究,即经GWAS研究筛选出在MHC区域与食管鳞癌发病可能有关的SNP位点,并对这些SNP位点在另外独立的样本进行Taq Man验证,进而确定在MHC区域与食管鳞癌高风险有关的SNP位点。2材料及方法2.1食管癌大样本生存分析2.1.1研究对象郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室联合多家医院和科研院所进行食管癌大规模随访调查,采用现场调研、肿瘤登记、医院核查和电话随访等方式收集患者资料。收集到40年跨度（1974-2013年）的食管癌患者资料共计61 012例,随访截止日期是2014年7月24日。1)研究对象的一般情况在生存期明确的61 012例患者中,男38 289例,最小年龄是15岁,最大年龄是104岁,平均年龄是59.876±9.480岁;女22 723例,最小年龄是24岁,最大年龄是99岁,平均年龄是60.548±9.513岁。2)研究对象的病理诊断在收集到患者的一般信息之后,即到各家患者诊治医院进行临床信息和病理资料的核对,记录下患者详实的食管癌组织学类型、大体类型、浸润深度、分化程度、食管癌部位、淋巴结转移、病理分级、TNM分期等病理信息。2.1.2研究方法1)资料收集首先,对所有参与工作的调查员进行严格培训,做到标准统一,采用问卷调查的方式获取患者信息,内容主要包括患者的一般情况（姓名、性别、年龄、职业、学历、民族、家庭详细地址、患者或亲属联系手机或电话号码等）,行为生活方式（吸烟史、饮酒史等）,临床特征（肿瘤家族史、患癌知情、就诊日期和治疗医院等）等;其次,采用医院病案和病理核查的方式收集患者临床信息和病理资料,内容包括过敏史、HP感染、组织学类型、大体类型、食管癌肿瘤部位、肿瘤长宽厚、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、病理分级、TNM分期、治疗方式和手术吻合方式等;最后,通过电话和家访等方式对患者进行生存期随访,获得预后信息。对收集到的所有资料进行科学整理,反复核对,逐步更新。2)生存分析采用SPSS 21.0统计软件;采用Kaplan-Meier法分析单因素（性别、年龄、肿瘤家族史、大体类型、浸润程度、淋巴结转移等）对患者生存期的影响,计算Log rank P值;多因素分析则采用Cox回归模型,将单因素有统计学意义的项目纳入,综合判断影响预后的因素,计算P值、HR值和95%CI;检验标准α=0.05。2.2 MHC区域食管癌GWAS研究2.2.1研究对象研究对象来自本课题组食管癌GWAS的样品,采用病例-对照实验设计方法。在GWAS初筛阶段,使用Illumina 610芯片对1 077例食管癌患者和1 733例对照进行基因分型,使用Illumina 660芯片对451例食管癌患者和374例对照进行基因分型。GWAS初筛共计3 635例,其中病例组1 528例（男921例,女607例,平均年龄61±19岁）;对照组2 107例（男1 052例,女1 055例,平均年龄31±15岁）。在验证阶段采用Taq Man技术在另外独立的2 026例患者和2 384例对照进行验证。Taq Man验证共计4 410例,其中病例组2 026例（男1 256例,女770例,平均年龄60±9岁）;对照组2 384例（男1 198例,女1 186例,平均年龄50±11岁）。病例组均经组织病理学确诊为食管鳞癌,对照组均经上消化道内镜检查显示无早期食管癌和其它上消化道肿瘤。2.2.2研究方法1)GWAS初筛采用主成分分析（principal component analysis,PCA）的方法,排除遗传学上偏倚度较大的人群。使用Illumina 610和660芯片对匹配的食管癌和对照组人群DNA进行全基因组SNP扫描分析。SNP位点排除标准:（1）在病例和对照组中样本得率（call rates）<95%;（2）对照组中最小等位基因频率（minor allele frequency,MAF）<1%;（3）对照组中哈迪·温伯格平衡律检验（Hardy-Weinberg equilibrium test,HWE）P<10-7。按此标准排除不合格SNP后,初步筛选出在MHC区域有可能与食管鳞癌高风险有关的SNP。2)TaqMan验证对初筛中筛选出的SNP位点进行再次筛选,Taq Man验证选取SNP位点的标准:（1）在病例和对照组中MAF>0.05;（2）对照组中HWE P≥0.001;（3）病例和对照组中GWAS分析（Cochran-Armitage趋势检验）P<10-4。采用此标准最后锁定和食管鳞癌高风险可能有关的SNP位点。采用Taq Man荧光定量基因分型技术,将筛选出的MHC区域SNP位点在另外独立的食管鳞癌和正常对照进行大样本量的验证。3)统计学分析计算在MHC区域检出SNP的样本得率、MAF和HWE。对质控后的数据用Plink1.03软件进行分析;采用Cochran-Armitage趋势检验,计算P值、OR值和95%CI,检验标准取α=0.05。3结果3.1食管癌大样本量生存分析结果3.1.1一般情况对食管癌生存期的影响女性患者生存期长于男性（Log rank P=0.000）;诊断年龄对食管癌患者预后有明显影响,随着诊断年龄的增大,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;民族对食管癌患者生存期没有影响（Log rank P=0.268）;学历对食管癌患者生存期有明显影响（Log rank P=0.000）;职业对食管癌患者生存期有重要影响（Log rank P=0.000）。3.1.2行为生活方式对食管癌患者生存期的影响吸烟史对食管癌患者生存期有显著影响,有吸烟史者生存期较无吸烟史者明显缩短（Log rank P=0.000）;饮酒史对食管癌患者生存期影响显著,有饮酒史者生存期较无饮酒史者显著缩短（Log rank P=0.000）。3.1.3高低发区对食管癌患者生存期的影响食管癌高低发区对患者生存期影响明显,高发区患者生存期明显长于中、低发区患者（Log rank P=0.000）。3.1.4临床特征对食管癌患者生存期的影响肿瘤家族史阳性患者的生存期显著长于家族史阴性患者（Log rank P=0.000）;血型对食管癌患者生存期无明显影响（Log rank P=0.996）;过敏史对食管癌患者生存期无明显影响（Log rank P=0.148）;单双眼皮对食管癌患者生存期有显著影响（Log rank P=0.003）;HP感染对食管癌患者生存期无明显影响（Log rank P=0.328）;食管癌患者HBV感染阳性和阴性间生存期无差异（Log rank P=0.102）;而HCV阳性患者生存期显著长于阴性者（Log rank P=0.001）;HIV阳性患者生存期明显长于阴性者（Log rank P=0.003）。3.1.5病理因素对食管癌患者生存期的影响食管鳞癌和癌肉瘤患者生存期长于食管腺癌,食管小细胞癌生存期最短（Log rank P=0.000）;不同肿瘤部位患者在总体生存期上差异有显著统计学意义,中下段食管癌患者生存期长于上段癌,颈段癌患者生存期最短（Log rank P=0.000）;肿瘤长径对食管癌患者生存期有显著影响,随着肿瘤长径的不断增长,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;食管癌肿瘤宽度也对患者生存期有明显影响,随着肿瘤宽度的不断增长,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;肿瘤厚度也对食管癌患者生存期有显著影响,随着肿瘤厚度的不断增长,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;不同大体类型患者在总体生存期上差异有统计学意义（Log rank P=0.000）;不同分化程度的食管癌患者生存期差异有显著性意义,分化程度越差,生存期越短（Log rank P=0.000）;浸润程度是食管癌患者生存期的重要影响因素,随着T分期的逐步加深,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;无淋巴结转移的食管癌患者生存期显著长于有淋巴结转移的患者（Log rank P=0.000）;随着淋巴结阳性转移个数的增多,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;淋巴结切除总数也对食管癌患者生存期有显著影响（Log rank P=0.000）;随着病理分级的逐步上升,患者生存期逐步缩短（Log rank P=0.000）;早期癌患者生存期显著长于食管癌中期患者,晚期患者生存期最短（Log rank P=0.000）。3.1.6治疗因素对食管癌患者生存期的影响治疗方式对食管癌患者生存期有显著影响（Log rank P=0.000）;手术吻合方式对食管癌患者生存期有显著影响,颈部吻合术生存期长于弓上吻合,弓下吻合生存期最短（Log rank P=0.000）;不同手术开胸方式患者生存期无差异（Log rank P=0.655）;患食管癌知情者的生存期显著长于患癌不知情者（Log rank P=0.000）;不同治疗年代的食管癌患者间的生存期差异有统计学意义（Log rank P=0.000）。3.1.7 Cox回归结果女性是影响食管癌预后的保护因素（p=0.000,HR=0.834,95%CI=0.799-0.870）;诊断年龄是食管癌患者的独立预后影响因素,≥70岁患者的死亡风险较<40岁患者明显增加（P=0.000,HR=1.856,95%CI=1.487-2.317）;肿瘤部位是食管癌患者的独立预后影响因素,下段癌患者较颈段癌患者死亡风险明显减低（P=0.006,HR=0.609,95%CI=0.426-0.869）;分化程度是食管癌患者的独立预后影响因素,未分化癌患者的死亡风险较高分化癌患者明显增加（P=0.002,HR=1.503,95%CI=1.155-1.957）;浸润程度是食管癌患者的独立预后影响因素（P=0.000,HR=1.372,95%CI=1.323-1.423）;淋巴结转移是食管癌患者的预后危险因素,无淋巴结转移患者较有淋巴结转移者死亡风险显著降低（P=0.000,HR=0.679,95%CI=0.626-0.737）;病理分级是食管癌患者的独立预后影响因素,IV级食管癌患者的死亡风险较0级患者明显增加（P=0.007,HR=3.169,95%CI=1.361-7.378）;治疗年代是食管癌患者的独立预后影响因素,近五年（2009-2013年）治疗的食管癌患者死亡风险较早十年（1974-1983年）治疗的患者明显增加（P=0.000,HR=4.145,95%CI=2.911-5.902）。3.2 MHC区域食管癌GWAS研究结果3.2.1食管癌GWAS初筛的MHC区域结果通过对1 528例病例和2 107例对照的PCA后,去除偏离的样品,得到遗传学上匹配的1 528例病例和1 056例对照的人群。对匹配人群的DNA进行全基因组SNP扫描,在MHC区域共检测出6 252个SNP位点。通过质量控制有2 533个SNP位点进入下一步的分析。3.2.2 TaqMan验证结果经过验证选取SNP位点的标准,去除不合格的SNP位点后,在MHC区域锁定5个可能与食管鳞癌高风险有关的SNP位点,分别是:rs17533090(P_GWAS=1E-05),rs35399661(P_GWAS=6E-06),rs1536501(P_GWAS=9E-04),rs911178(P_GWAS=6E-04)和rs6901869(P_GWAS=3E-05)。在对2 026例病例和2 384例对照的Taq Man验证后,验证出1个有意义的SNP位点:rs911178（P replication=1.41E-22）,定位于6p22.1,在SCAN domain containing 3（SCAND3）上游35-kb的位置。4结论4.1性别、诊断年龄、食管癌部位、肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移、病理分级和治疗年代是食管癌患者的独立预后影响因素;吸烟史、饮酒史、高低发区、肿瘤家族史、组织学类型、肿瘤长径、宽度、厚度、大体类型、淋巴结转移阳性个数、临床分期、治疗方式、手术吻合方式和食管癌患者生存期相关;生存分析对食管癌临床防治提供有力依据。4.2 MHC区域rs911178（SCAND3基因）和食管鳞癌高风险显著相关;本研究加深了对食管鳞癌发病中MHC区域作用的认识,为建立高危人群筛查的手段和方法提供了非常重要的线索。