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半月板是膝关节的重要结构之一,具有承受和传导载荷、吸收震荡、润滑关节和稳定关节等作用[1.2.3]。半月板因创伤和先天性畸形在骨科临床工作中相当多见[4],目前的治疗手段多半是手术切除或部分切除损伤或畸形的半月板[4.5],解除患者的病痛,取得了相当满意的效果,因为如果不进行手术治疗,任其病情自然发展,往往导致膝关节晚期骨性关节炎的出现,手术切除或部分切除半月板虽然是目前治疗半月板损伤或畸形的主要手段,但其远期效果并非十全十美,仍然有一些不尽人意的并发症出现[6.7],所以,随着组织工程技术[59]的出现,人们追求更加完美的手段来替代现有的治疗措施,组织工程技术是人们试图用来改变现有治疗手段的方法之一[8.9.10.11]。本实验设计从损伤或畸形的半月板组织中获取纤维软骨细胞作为种子细胞,在体外单层培养并在各种细胞因子作用下大量增殖分化,产生大量的种子细胞,同时检测种子细胞的生物学特性[12.13],之后,拟将种子细胞与支架结合,种植于裸鼠皮下,构建出组织工程化人膝关节半月板,最后检测组织工程化半月板的生物学特性,并比较组织工程化半月板与半月板之间的差异。内容:1.种子细胞的优化获取的方法:从手术中切除下来无变形或严重炎症反应的半月板组织,经胰蛋白酶,透明质酸酶和胶原酶的消化而获取人膝关节半月板纤维软骨细胞,进行原代和传代单层培养。2.测定原代和传代的纤维软骨细胞的生物学特性:研究方法包括细胞倒置显微镜下的形态表现,细胞计数,HE染色,免疫组化染色,细胞贴壁率,生长曲线,各种细胞因子作用下纤维软骨细胞的增殖情况如细胞数目的增加、总RNA含量的测定、特异性mRNA表达等。3.构建组织工程化人膝关节半月板,将不同代次的纤维软骨细胞与支架结合,体外培养一段时间后植入裸鼠皮下,在不同的时间段,分别取出,测定其生物学特性,并与正常半月板的生物学特性进行比较,因此检验组织工程化半月板是否能满足临床需要。结果:1.手术中切下的无炎症反应或没有变性的人膝关节半月板组织可以作为种子细胞的来源之一[14],通过酶消化法[15.16],能够获取大量的种子细<WP=9>胞,作为组织工程种子细胞的主要来源,满足实验的要求。2.纤维软骨细胞的生物学特性:(1)纤维软骨细胞的贴壁率随着接种时间的延长,贴壁率逐渐增加,原代和传代细胞之间的贴壁率有明显的差异,适宜的接种密度适合于细胞增殖分化接种密度0.4×104/cm2细胞增殖缓慢,而接种密度大于4×104/cm2无助于提高小贴壁率;含10%小牛血清的DMEM-F12培养剂适合于细胞增殖分化,提高血清浓度并不能增加细胞的贴壁率;(2)纤维软骨细胞的生长曲线符合一般的规律[17],接种后第一天都有微小的下降,之后逐渐上升,达到平台期,接着缓慢下降。(3)Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA表达:体外单层培养的半月板纤维软骨细胞能表达Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA,在各种细胞因子刺激之下mRNA表达上调,总RNA量比未受细胞因子刺激的情况下多。两者有明显的差异(P<0.05=。(4)甲苯胺蓝染色显示蛋白多糖主要是GAG的合成。3.组织工程化半月板外观形态具有接近正常半月板的结构,剖面结构致密,纤维排列纵横交错,组织切片可以明显显示出纤维软骨细胞,免疫组化检测可以测出Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的形成,MRI检测具有接近正常半月板的低信号影像特征[18.19]。结论:1.手术中切除下来的半月板组织可以作为组织工程培养的种子细胞的来源之一,经过优化获取可以得到大量的种子细胞。2.体外单层培养的半月板纤维软骨细胞具有正常细胞的生物学特性,符合作为种子细胞的多种生物学要求。正常体外单层培养的半月板纤维软骨细胞能有效分泌细胞外基质,合成胶原和蛋白多糖(主要是糖胺聚糖GAG)[20]。3.体外构建人组织工程化半月板是可行的,组织工程化人半月板具有接近正常半月板的某些特性,这为人工构建组织工程化半月板提供的一条可行的方法。