1980年以前,人们普遍认为包涵体中的蛋白质是没有活性的,需要在体外进行复性后才能使蛋白质具有活性。近年来,越来越多的研究表明,某些蛋白质或酶,虽然表达在包涵体中,但依然保留其活性,这种包涵体被称为活性包涵体(Active Inclusion Bodies)。与可溶性表达的酶相比,在活性包涵体中表达的酶具有很多优点,例如增加蛋白的表达量,提高蛋白质的稳定性,易于提取和纯化,并且可以重复使用等。活性包涵体中的蛋白质,是一种不可溶的聚集体,通常伴随着蛋白质构象的改变。然而,由于酶表达在活性包涵体中而导致酶的反应和底物专一性发生变化这一观点暂未被报道。为了解决这个问题,我们选择了在生物技术和工业上有广泛应用的三种酶。尿卟啉原III甲基转移酶(Uroporphyrinogen III methyltransferase,UMT),作为一种红色荧光标记,能够催化多步甲基化反应。真核生物的丝氨酸消旋酶(Serine racemase,SR),能够催化D-丝氨酸及其对映的异构体L-丝氨酸的消旋反应,以及D-和L-丝氨酸的脱水反应。人类D-氨基酸氧化酶(human D-amino acid oxidase,hDAAO)能够催化多种D-氨基酸的高效氧化。已报道,表达在包涵体中的酵母DAAO是具有活性的,目前还没有关于表达在包涵体中的UMT和SR的催化活性的报道。我们构建了可以表达为可溶的和不可溶的两种状态的三种酶,在大肠杆菌中过表达这三种酶,并且对它们的活性进行了分析。研究结果如下:1.酶的构建。无标签大麦UMT突变体UMT8是可溶性表达的,由于融合标签对荧光蛋白的催化作用几乎没有影响,我们构建了C-端融合了疏水标签ELK16的UMT8,从而降低了UMT8蛋白的可溶性表达。构建无标签玉米SR则是为了防止N或C端融合标签对玉米SR的催化活性具有潜在影响。hDAAO融合SUMO标签,可以促进蛋白的可溶性表达。所有的基因都是在T7启动子的控制下表达的。2.在大肠杆菌中过表达重组蛋白。构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。将可溶的和不可溶的目的蛋白进行分离和SDS-PAGE检测。融合ELK16的UMT8在包涵体中表达。无标签的玉米SR和融合了SUMO的hDAAO在上清和沉淀中都有表达。3.大麦UMT8蛋白可溶态和不可溶态的荧光分析。紫外光谱扫描结果显示,表达大麦UMT8的可溶性蛋白有两个吸收峰,分别是在354nm和375nm,它们是二甲基化和三基化反应的荧光产物的特异性吸收峰,相反地,表达大麦UMT8-ELK16的可溶性蛋白的这两个吸收峰明显减小,说明UMT8形成不溶性聚集体使其催化活性降低。荧光光谱扫描分析,结果显示融合ELK16标签,降低了大麦UMT8三步甲基化反应的荧光产物在细胞内的聚集,大麦UMT8蛋白的可溶性降低会抑制其催化多步甲基化反应。4.可溶态和不可溶态的玉米SR催化消旋反应和脱水反应的活性测定。可溶性表达的玉米SR同时具有消旋酶活性和脱水酶活性,而不可溶的玉米SR的脱水酶活性丧失。体外添加甘油和还原剂二硫苏糖醇(DTT),二者对两种状态的玉米SR的催化反应专一性具有不同的影响。结果说明玉米SR在活性包涵体中表达时,改变了其催化反应的特异性。5.表达在活性包涵体中的SUMO-hDAAO的产量与底物专一性分析。对融合蛋白的包涵体相对产量进行测定,28℃诱导的SUMO-hDAAO包涵体占细胞湿重的比值为17.71%;而在37℃诱导的条件下,相对比值提高到了37.99%。不可溶的hDAAO也显示出相应的氧化三种D-氨基酸的底物特异性,但可溶的和不可溶的hDAAO蛋白质之间的催化反应活性的改变略有不同,说明活性中心的轻微的构象变化是由hDAAO的不可溶表达导致的。综上所述,所选择的三种酶被有效地用作研究催化反应和底物特异性的工具酶。不可溶的玉米SR脱水酶活性的丧失,使玉米SR在生产中具有潜在的用途,被用于固定化生产D-丝氨酸。标记的不可溶的hDAAO保留了相应的底物特异性。表达在活性包涵体中的hDAAO具有容易筛选提取的特点,使其可能成为治疗帕金森病的特异性抑制剂。