中国桃褐腐病菌及其抗药性相关研究

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本研究第一次系统地描述了我国的桃褐腐病菌,确定了包括一个新种,一个新新记录种在内的三种桃褐腐病菌。克隆并分析了不同桃褐腐病菌的交配型位点,揭示了桃褐腐病菌为异宗配合真菌。此外,对我国广泛分布的美澳型核果褐腐病菌Moniliniafructicola进行了遗传多样性分析,并评估了其对QoI类杀菌剂产生抗药性的风险,最后筛选了一种适合利用M. fructicola菌株菌丝测定对SDHI杀菌剂敏感性的培养基,具体结果如下:1.通过对我国桃褐腐病菌生物学性状和对其ITS序列,微管蛋白(TUB2)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)基因片段的测序分析,明确了我国的桃褐腐病菌共有3个种,分别是M. fructicola,新记录种Monilia mumecola,和新种Monilia yunnanensis sp. nov.。对ITS, TUB2和G3PDH的系统发育分析表明M. yunnanensis与欧洲最为普遍的桃褐腐病菌M. fructigena最为相近。有趣的是,M. yunnanensis和M. fructigena的Cyt b基因在内含子/外显子结构分布上差异明显。三种桃褐腐病菌中,M. fructicola在我国分布最广,从北京,山东,湖北,浙江,福建,陕西,甘肃以及云南等地的病桃上都分离到了M. fructicola, M. mumecola之前仅在日本的梅上分离到,本研究首次从湖北省桃上分离到该种。M. yunnanensis则是我们新发现的一个种,目前为止仅从云南,陕西等省分离到。同时设计了一个多重PCR检测方法,可快速鉴定我国桃褐腐病菌M. fructicola, M. mumecola和M. yunnanensis。2.克隆了桃褐腐病菌全部五个种的交配型位点,经过测序分析表明M.fructicola, M. fructigena, M. laxa, M. mumecola和M. yunnanensis菌株都为异宗配合真菌。在所有桃褐腐病原菌MAT1-1型菌株交配型位点上,包含一个MAT1-1-5基因和含有alpha-domain的MAT1-1-1基因,而MAT1-2型菌株交配型位点上则存在一个含HMG-domain的基因MAT1-2-1与MAT1-2-4。此外,M. yunnanensis的MAT1-2型菌株MAT1-2-4下游的非编码区中存在一段930bp的插入。进一步分析发现,所有MAT1-1型菌株交配型位点中都含有MAT1-2-1的部分片段,而MAT1-1型菌株的MAT1-1-1与MAT1-2型菌株的MAT1-2-4基因之间具有77.4%~91.8%的序列相似性(覆盖率为7.6%~27.8%)。利用不同桃褐腐菌株间’idiomorph’区域的差异,设计了三个特异性引物鉴定桃褐腐病菌全部五个种的交配型。进而根据PCR结果,选取了不同交配型的M. mumecola菌株和M. yunnanensis菌株分别同时接种桃,最后成功诱导出M. yunnanensis的子囊盘。3.利用RAPD技术对我国不同地区的M. fructicola菌株进行多样性分析,结果表明福建菌株遗传距离与其它菌群最远。Nei氏多样性指数和香农多样性指数表明北京的菌株群体的多样性最高。这些结果揭示了M. fructicola菌株可能早在2005年,其被首次报道以前就已经存在于我国。4.克隆并测序分析了M. fructicola菌株QoI类杀菌剂的靶标Cyt b基因,基因全长11927bp,包含7个长度为1592,1318,1166,1252,1065,2131和2227bp的内含子,分别位于其cDNA序列的第201,393,429,490,506,779和811位。其中,上述1166bp的内含子为Ⅰ型自剪切内含子,位于Cytb基因cDNA序列429位(氨基酸序列143位)。PCR扩增测序表明美国和中国的M. fructicola菌株Cytb基因143位点后都存在此内含子,预示着143位点的1166bp内含子是广泛存在的。虽然143位点发生突变(G143A)是植物病原菌抗QoIs的突变热点,但由于M.fructicola菌株普遍存在143位点的1166bp内含子,其产生G143A突变从而导致对QoIs高抗性的可能性极小。5.当使用富营养培养基(如PDA)测定M. fruticola菌丝对SDHI类杀菌剂的敏感性时,即使在含高浓度SDHIs的培养基中也不能完全抑制菌丝生长。而在所测试的培养基中,MM培养基不仅能使菌丝最快生长,而且在低浓度的SDHIs存在时,就能很好地抑制M. fructicola菌丝生长。MM培养基上,M. fructicola菌株对啶酰菌胺(boscalid),氟吡菌酰胺(fluopyram)和吡噻菌胺(penthiopyrad)的ECso分别为0.013~2.134μg/ml,0.059~15.557μg/ml,和0.0002~0.4582μg/ml三种SDHI类杀菌剂之间存在显著的交互抗性。
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