实验目的疟疾是由疟原虫感染引起的,最为严重的寄生原虫感染性疾病。全球疟疾流行区域正以惊人的速度不断扩展,严重的疟疾疫情正是造成发展中国家儿童高死亡率和成人高发病率的主要原因。而疟原虫抗原变异和耐药性原虫的出现,又进一步阻碍了疟疾疫苗的研制和抗疟药物的开发。因此,进一步阐明诱导抗疟保护性免疫应答的相关机制,无疑将为疟疾的有效控制提供必须的前提依据。啮齿类疟原虫感染小鼠为深入探讨抗人疟保护性免疫应答机制,提供了一种宝贵的实验动物模型。约氏疟原虫（Plasmodium yoelii 17XL,P.yoelii 17XL）感染的不同小鼠,会呈现不同的Th1细胞免疫应答模式,因而导致其出现自愈和死亡两种截然相反的感染结局。因此,疟疾感染早期Th1细胞免疫应答的有效建立明显影响着感染进程和最终结局。然而,目前关于参与调控宿主抵抗红内期疟疾感染的Th1细胞免疫应答的相关机制尚不明确。表达不同模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）的树突状细胞（Dendritic ceils,DCs）,在T细胞活化和适应性免疫应答建立过程中,发挥着举足轻重的作用。有研究已经证实,DCs可分为髓样DCs（CD11c⁺CD11b⁺）和浆样DCs（CD11c⁺CD45R/B220⁺）两种不同亚群,两者在病原体刺激下通常呈现不同的增殖模式。体外的研究也进一步表明,DCs可选择性吞噬疟原虫寄生的红细胞（pRBC）,加工和提呈疟原虫抗原给CD4⁺T细胞进而诱导保护性Th1细胞免疫应答的建立。这一结果充分提示,作为抗原提呈细胞（Antigen Present Cell,APC）的DCs在疟疾感染过程中可能发挥重要作用。然而,其它的研究却显示,疟原虫感染明显抑制DCs的活化和功能的发挥。我们利用成功建立的P.yoelii 17XL感染的BALB/c和DBA/2鼠疟模型,分析了参与抗疟免疫应答调控的相关因素。前期的研究结果显示,两种小鼠由于诱导Th1细胞免疫应答的能力不同,因而呈现易感和抵抗两种不同的应答模式。为探讨Pyoelii 17XL感染早期易感和抵抗小鼠Th1细胞免疫应答的差异是否与DCs的调控作用具有一定的相关性,本研究动态观察了感染早期DCs细胞表面和细胞内TLR的表达水平、亚群的增殖变化、表面及共刺激分子的表达水平和细胞因子的分泌模式,以期阐明DCs在疟疾感染早期的作用地位及其相关机制。实验方法1、实验动物及其模型构建6-8周龄、雌性BALB/c和DBA/2小鼠,经腹腔分别感染1×10⁶ P.yoelii 17XL寄生的红细胞（pRBC）,构建不同的实验动物模型。2、采用流式细胞分析技术检测易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs细胞内TLR9和细胞表面TLR4的表达水平（1）无菌取出感染前（0d）和感染后第3d、5d小鼠脾脏,常规方法制备脾细胞悬液,用0.17 mol/L NH₄Cl裂解红细胞。以含10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640调整脾细胞终浓度为1×10⁷/ml。每份样品用抗-CD11c-FITC单克隆抗体和抗-TLR9-PE单克隆抗体进行双色分析,另设阴性对照管。预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml,再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体进行表面染色。按试剂说明书所示,进行固定和透膜后,再分别加入biotinylated anti-TLR9单克隆抗体和PE-conjugated streptavidin。离心去上清后,洗涤两次,静置15 min,流式细胞仪进行检测。（2）每份样品用抗-CD11c-FITC单克隆抗体和抗-TLR4-PE单克隆抗体进行双色分析,另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml,再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体和抗-TLR4-PE单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后,洗涤两次,静置15 min,流式细胞仪进行检测。3、采用流式细胞分析技术检测易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs亚群的数量及细胞表面MHCⅡ类分子和共刺激分子CD40、CD80的表达水平（1）每份样品用抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体和抗-CD45R/B220-PerCP单克隆抗体进行三色分析,另设阴性对照管。预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 ml,再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体和抗-CD45R/B220-PerCP单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后,洗涤两次,静置15 min,流式细胞仪进行检测。（2）每份样品用抗-CD11c-FITC单克隆抗体和抗-MHCⅡ-PE单克隆抗体或抗-CD40-PE单克隆抗体或抗-CD80-PE单克隆抗体进行双色分析,另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 ml,再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体和抗-MHCⅡ-PE单克隆抗体或抗-CD40-PE单克隆抗体或抗-CD80-PE单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后,洗涤两次,静置15 min,流式细胞仪进行检测。4、采用双抗体夹心ELISA法检测感染早期易感和抵抗小鼠DCs培养上清中IL-12p40以及免疫调节性细胞因子IL-10和TGF-β1的含量（1）脾DCs的纯化及培养分别于感染前和感染后第3d和5d常规无菌取出小鼠脾脏,用1 mg/ml胶原酶Ⅳ（Sigma Aldrich）37℃作用30 min,以0.17mol/L NH₄Cl裂解红细胞。以含10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640调整脾细胞终浓度为1×10⁷/ml。按照小鼠脾DCs纯化试剂盒（BD Pharmingen San Diego,CA）说明书所示,从小鼠脾细胞悬液中阴性选择纯化脾DCs。生物素标记的小鼠DCs纯化鸡尾酒抗体能够识别除了DCs以外的所有白细胞表面表达的抗原并与之结合。链酶亲和素标记的磁珠可以与生物素标记的鸡尾酒抗体特异性结合。因为这两种试剂在纯化DCs过程中,并不与DCs直接作用,因而可以避免DCs的异常活化。具体操作如下:20×10⁶个脾细胞首先与2.4G2 mAb冰上共同孵育15 min,阻断Fc受体。每1×10⁶个脾细胞加入5μl生物素标记的小鼠DCs纯化鸡尾酒抗体,冰上孵育15 min,洗涤、离心后,再加入5μl链酶亲和素标记的磁珠,6～12℃冷藏作用30 min。将标记细胞转移至17×100mm圆底实验管中,并置于细胞分选器中作用8 min。仔细吸取上清（即为纯化的DCs）,并置于无菌管中。用抗-CD11c-FITC单克隆抗体标记纯化的DCs,经流式细胞仪检测确定,CD11c⁺DCs纯度可达到约70～85%。将脾DCs终浓度调整为1×10⁶/ml,于24孔培养板中,每孔加入500μl,培养48 h后,收集培养上清,-80℃保存,待IL-12p40、IL-10和TGF-β1检测。（2）用双抗体夹心ELISA法对小鼠脾DCs培养上清中IL-12p40、IL-10和TGF-β1的含量分别进行检测,酶标仪检测450nm处OD值。应用SoftMax Pro 4.3.1LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量（pg/ml）。实验结果1、易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs细胞内TLR9和细胞表面TLR4表达水平的比较BALB/c和DBA/2小鼠表达TLR9的CD11c⁺ DCs的数量从感染后第3d开始均明显升高,并于感染后第5d达到最高水平,但在任一时间点,两者比较均无统计学差异。与感染前的对照组相比,BALB/c和DBA/2小鼠在感染后第3d和第5d表达TLR4的CD11c⁺ DCs的数量均未见有意义的变化。2、易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs亚群数量的比较BALB/c和DBA/2小鼠脾脏CD11c⁺CD11b⁺DCs的数量从感染后第3d开始均明显升高,并于感染后第5d达到最高水平。在感染后第3d,BALB/c小鼠脾脏CD11c⁺CD11b⁺DCs的数量明显低于DBA/2小鼠。与此相反,两种小鼠脾脏CD11c⁺CD45R/B220⁺DCs的数量在感染后3～5d,尽管也呈逐渐增高趋势,但BALB/c小鼠CD11c⁺CD45R/B220⁺DCs的数量在感染后第3d和第5d均显著高于DBA/2小鼠。3、易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs细胞表面MHCⅡ类分子和共刺激分子CD40、CD80表达水平的比较BALB/c和DBA/2小鼠表达MHCⅡ类分子和CD40分子的CD11c⁺DCs的数量从感染后第3d开始均明显升高,并于感染后第5d达到最高水平。在感染后第3d和第5d,BALB/c小鼠表达MHCⅡ类分子和CD40分子的CD11c⁺DCs的数量明显低于DBA/2小鼠。与此同时,DBA/2小鼠表达CD80分子的CD11c⁺DCs的数量从感染后第3d开始迅速升高,并于感染后第5d达到峰值水平。而BALB/c小鼠表达CD80分子的CD11c⁺DCs的数量仅在感染后第5d明显升高,但其水平明显低于DBA/2小鼠。4、易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs培养上清中IL-12p40以及免疫调节性细胞因子IL-10和TGF-β1的含量比较感染后第3d,DBA/2小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平迅速升高,感染后第5d尽管呈下降趋势,但仍明显高于正常水平。相比,BALB/c小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平在感染后第3d和第5d均未见有意义的升高,而且其水平均明显低于DBA/2小鼠。两种小鼠DCs培养上清中IL-10和TGF-β1水平在感染后第3～5d均明显升高,但BALB/c小鼠DCs培养上清中IL-10和TGF-β1水平明显高于DBA/2小鼠。结论1、P.yoelii 17XL感染早期,TLR9是介导小鼠DCs活化的重要模式识别受体。2、P.yoelii 17XL感染早期,易感BALB/c小鼠和抵抗DBA/2小鼠DCs亚群的分化模式存在显著差异。3、P.yoelii 17XL感染早期,易感BALB/c小鼠和抵抗DBA/2小鼠成熟表型的特征性分子MHCⅡ类分子、CD40和CD80分子在表达水平和时相上均存在显著差异。4、P.yoelii 17XL感染早期,DCs可通过分泌IL-12启动感染早期Th1细胞免疫应答的建立。5、P.yoelii 17XL感染早期,DCs可通过分泌免疫调节性细胞因子IL-10和TGF-β调节Th1细胞免疫应答的水平和效应强度。6、P.yoelii 17XL感染早期,DCs是决定Th1细胞免疫应答有效建立的关键免疫效应细胞之一。