论文部分内容阅读
【背景】颅脑创伤（TBI）后继发性脑损伤可诱导神经元死亡及再生障碍,其相关机制尚未完全明确。星形胶质细胞在中枢神经系统内分布最为广泛,损伤激活后可分化为具有神经毒性作用的A1型以及具有神经保护作用的A2型。TBI后早期星形胶质细胞主要向A1型转化,抑制神经元再生,其机制尚未见报道。micro RNA作为一类小分子非编码RNA,通过降解靶基因m RNA或阻碍其翻译抑制靶基因的表达,参与调控细胞生理病理进程。目前,尚未见有关TBI后差异表达micro RNA对星形胶质细胞表型转化以及后续对神经元再生相关作用的报道。本研究拟通过高通量基因测序技术检测TBI后星形胶质细胞micro RNA表达谱差异并验证差异表达micro RNA对星形胶质细胞表型转化以及对损伤神经元再生的作用及其机制。【实验目的】探究颅脑创伤（TBI）后星形胶质细胞micro RNA表达谱差异并验证差异表达micro RNA对星形胶质细胞表型转化以及对损伤神经元再生的作用及其机制。【实验方法】使用细胞损伤控制仪II型（CIC II）构建大鼠原代星形胶质细胞体外牵张损伤模型,阀门压力设定为40 PSI,模拟重型颅脑损伤。损伤后24小时收集对照组及损伤组星形胶质细胞总核糖核酸（RNA）,使用Agilent micro RNA微阵列芯片检测差异表达micro RNA,通过R语言软件构建火山图及聚类分析热图;利用DIANA TOOLS和miRDB数据库预测micro RNA的靶基因,并对靶基因集进行基因本体论（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析;使用STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络,应用Cytoscape软件筛选关键基因。随后分析芯片数据集中差异表达最大的micro RNA在TBI后星形胶质细胞表型转化以及对损伤神经元再生中的作用及其相关机制。提取并培养SD大鼠原代星形胶质细胞和神经元,并通过特异性免疫荧光染色进行鉴定。分别构建星形胶质细胞及神经元体外划痕损伤模型。并采用RT-q PCR法验证划痕损伤后星形胶质细胞内rno-miR-34b-5p的表达水平改变以及rno-miR-34b-5p抑制剂的抑制效率。使用Western blot法检测划痕损伤后以及rno-miR-34b-5p抑制剂加入后A1型星形胶质细胞特异性分子标志物C3、A2型星形胶质细胞特异性分子标志物S100A10表达水平改变,并检测生信分析预测相关的信号通路蛋白分子表达水平改变。将经rno-miR-34b-5p抑制剂处理的星形胶质细胞培养基与神经元培养基等比例混合后对神经元继续培养,通过Western blot检测神经元再生相关分子（PSD-95、Glu R1以及GAP43）的表达水平。【结果】大鼠原代星形胶质细胞体外牵张损伤24小时后共有9个micro RNA差异表达（|Log2 Fold Change（FC）|≥0.26,p＜0.05）,其中5个表达上调,分别是rno-miR-34a-5p、rno-miR-34b-5p、rno-miR-129-5p、rno-miR-140-3p和rno-miR-7a-5p;4个表达下调,分别是rno-miR-199a-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p和rno-miR-1306-3p。rno-miR-34b-5p差异表达倍数最为显著,对其进行靶基因预测共获得154个基因,进一步的GO和KEGG富集分析发现,rno-miR-34b-5p靶基因参与蛋白磷酸酶2A结合及磷脂酶C活性正向调节,并调控磷脂酶D信号通路、MAPK信号通路及PI3K/AKT信号通路,与TBI后神经修复及再生密切相关。同时使用靶基因集构建PPI网络,筛选5个关键基因,分别为Tp53、Notch1、Kitlg、Pdgfrb和Pdgfra。在体外实验中,星形胶质细胞经划痕损伤激活后,rno-miR-34b-5p的表达量显著上升（p＜0.05）,与芯片结果相符。同时,体外划痕损伤后A1型星形胶质细胞特异性分子标志物C3表达升高（p＜0.05）,A2型星形胶质细胞特异性分子标志物S100A10表达显著降低（p＜0.05）,说明损伤后反应性星形胶质细胞以A1型为主。星形胶质细胞划痕损伤后加入rno-miR-34b-5p抑制剂可显著抑制细胞内rno-miR-34b-5p表达（p＜0.05）,并抑制C3蛋白表达（p＜0.05）,上调S100A10、p-AKT和p-m TOR表达（p＜0.05）,诱导星形胶质细胞向A2型转化。随后将经rno-miR-34b-5p抑制剂处理的星形胶质细胞培养基与神经元培养基等比例混合后对神经元继续培养,Western blot检测发现rno-miR-34b-5p抑制剂处理星形胶质细胞上清较其对照组显著促进损伤神经元再生相关蛋白表达（p＜0.05）。【结论】星形胶质细胞体外划痕损伤后,细胞向A1型转化,胞内rno-miR-34b-5p含量显著升高,抑制rno-miR-34b-5p表达可阻碍星形胶质细胞向A1型转化,并经PI3K/AKT通路促进星形胶质细胞向A2型转化,促进损伤神经元神经再生。本研究提示miR-34b-5p可能为TBI后神经修复和再生的一个关键分子,为TBI后康复治疗提供了潜在的作用靶点及新的研究方向。