内质网监控蛋白质加工并保证蛋白质能准确地折叠,内质网中钙离子稳态的改变、蛋白质过量生成和未折叠或错误折叠蛋白质蓄积能引发细胞特异性内质网应激反应。内质网应激主要激活三条信号通路:未折叠蛋白反应(unfolded proteinresponse,UPR),内质网超负荷反应和固醇调节级联反应。UPR的最初目的是适应环境的改变,通过跨膜蛋白ATF6、PERK、IRE1/XBP1转导内质网UPR的信号,恢复内质网正常功能。但是,如果这些适应性反应不能有效去除应激状态,过强或长期的内质网应激将导致细胞出现副作用,如凋亡和胰岛素抵抗等。内质网应激是肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病之间的一种分子联系,内质网应激可以导致胰岛素受体信号的抑制,而这种抑制作用是通过IRE-1α依赖性JNK激活所致。固醇调节级联反应是在内质网表面合成的胆固醇损耗所致,内质网应激,在内质网膜表面合成胆固醇的耗竭可激活固醇调节反应结合蛋白(SREBPs),其中,SREBP-1c是调控肝脏脂质代谢有关酶的重要转录因子,能选择性调控脂肪酸、甘油三酯以及糖代谢(如葡萄糖激酶)相关基因的表达水平。　　 作为一种合成激素,胰岛素能明显促使蛋白质的合成。如果胰岛素诱导合成的多肽链超过了内质网蛋白质的折叠能力将导致内质网正确折叠蛋白或未折叠蛋白的增加,从而引起内质网应激。那么,在1型和2型糖尿病治疗中被广泛应用的胰岛素是否会引起内质网应激并因此而导致胰岛素抵抗目前尚未有相关的研究证实。一些临床研究发现胰岛素治疗能改善全身胰岛素抵抗或抑制肝糖输出,但在动物实验中胰岛素治疗对肝脏胰岛素信号通路的作用及其分子机制目前不还清楚。胰岛素是SREBP1的激活因子,能导致肝细胞和脂肪细胞脂肪沉积增加,但在2型糖尿病大鼠中,胰岛素治疗是否也会导致肝脏脂肪沉积增加也值得进一步的研究。本研究先建立2型糖尿病动物模型,给予胰岛素治疗,然后检测肝脏胰岛素信号通路活性、肝糖异生关键酶的表达、JNK活性、IRE1a/XBP1通路、BiP及SREBP1等指标的变化,探讨胰岛素对肝脏内质网应激和胰岛素敏感性的作用及其分子机制,并且研究胰岛素治疗对肝脏脂肪沉积的影响并探讨其机制。　　 研究目的:　　 1.研究胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠肝脏内质网稳态的影响　　 2.研究胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素敏感性的影响及其分子机制　　 3.观察胰岛素治疗对肝脏脂肪沉积的影响并探讨其分子机制　　 1材料与方法:　　 1.1动物模型:　　 8周龄清洁级近交系雄性SD大鼠60只,重约200g左右,适应性喂养两周后,将SD大鼠随机分成常规饲料喂养组(NC,n=10)和高脂饲料喂养组(HFD,n=50)。分别用相应饲料喂养5周,第5周末禁食12小时后,HFD组大鼠腹腔内一次性注射STZ(STZ40mg/kg体重)。注射STZ三天后测非空腹血糖。非空腹血糖大于16.7mmol/L为糖尿病大鼠。将这些糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(DM,n=6,不给予药物干预)、早期胰岛素治疗(EI,n=6,STZ注射三天后诊断为糖尿病即开始给予皮下胰岛素注射)、达美康治疗组(GT,n=6,STZ注射三天后诊断为糖尿病即开始给予达美康灌胃治疗)和晚期胰岛素治疗组(LI,n=6,STZ注射一月后开始给予皮下胰岛素注射),正常对照组和糖尿病组大鼠给予相同体积的生理盐水皮下注射治疗,疗程为三周。目标血糖为4-8mmol/L,根据血糖浓度调整胰岛素和达美康的剂量。　　 1.2腹腔葡萄糖耐量试验　　 胰岛素和达美康治疗结束两天后进行腹腔葡萄糖耐量试验。禁食12小时后,给予大鼠腹腔注射1.5克k_1体重50％的葡萄糖。尾静脉取血(0分钟、30分钟和120分钟)作血糖和血清胰岛素检测,以葡萄糖曲线下面积和胰岛素曲线下面积计算葡萄糖胰岛素指数。　　 1.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)　　 肝脏总蛋白用细胞裂解液提取,14000rpm离心后取上清液分装备用。蛋白浓度使用BCA法测定,每个样本加入上样缓冲液,每泳道加入约100ug蛋白。65V电泳,待溴酚蓝越过浓缩胶后改为200V,蛋白分离后开始转膜,电压110V。转膜后6％脱脂牛奶封闭1小时,4℃过夜孵育一抗,洗膜后常温下孵育二抗1小时,再用TBST洗膜后曝光,选取清晰的X光胶片进行图像分析。　　 1.4磷酸化IRS1的检测　　 加IRS1抗体至样品中,4℃摇床上孵育过夜,加入0.04ml蛋白A至小cup中,4000g离心1分钟,将免疫复合物加入小cup中,孵育10分钟,4000g离心1分钟,加0.5ml Binding/wash buffer至小cup中4000g离心1分钟,加190ulElution Buffer至免疫复合物中,4000g离心1分钟,收集液层作SDS-PEGA电泳、转膜、孵育一抗和二抗及曝光。　　 1.5JNK活性检测　　 加20ul珠子至200ul样品中后4℃摇床上孵育过夜。4℃离心,14000g,10min。加500ul1×cell lysis buffer洗洗涤沉淀物2次,加500ul1×kinase buffer,旋转洗涤沉淀物2次,弃上清,加50ul1×kinase buffer,200MATP重悬沉淀物,4℃水浴箱内孵育30分钟,加25ul3×SDS Sample buffer终止反应,常温下离心30秒。收集液层作SDS-PEGA电泳、转膜、孵育一抗和二抗及曝光。　　 1.6肝脏甘油三酯提取　　 100毫克肝组织在冰冷的氯仿-甲醇(体积比为2:1)溶液中手动匀浆。在室温下孵育5小时后加氯仿,离心。收集底部沉渣、风干后在融解在氯仿中,离心后收集上清夜使用酶法检测。　　 1.7 Real Time PCR　　 采用Sybrgreen染料法,以β-actin为内参基因,对HIF1α和Glut1基因的mRNA表达量进行检测,反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,相对定量实验需要进一步用样品的目的基因减去管家基因测得值来校正误差,所得结果代表样品目的基因的相对含量。　　 1.8统计分析　　 数据用均数±标准差表示,两组间比较使用t检验,多组之间比较用方差分析。P<0.05为有统计学意义。　　 2结果:　　 2.12型糖尿病模型的建立　　 为了建立2型糖尿病动物模型,本研究使用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素。血清胰岛素水平和甘油三酯在高脂饮食喂养5周时升高,提示SD大鼠存在胰岛素抵抗。注射小剂量STZ三天后血糖水平显著升高,研究结束是糖化血红蛋白也明显升高,除此之外,这些糖尿病大鼠也表现出对胰岛素促泌剂有反应,这些结果说明了本研究诱导出了一种具有2型糖尿病典型代谢特点的大鼠模型。　　 2.2胰岛素对2型糖尿病大鼠的治疗效果　　 为了研究胰岛素治疗的作用机制,胰岛素的治疗活性在动物模型中被调查。早期胰岛素治疗组糖代谢指标如空腹血糖和糖化血红蛋白以及甘油三酯水平均明显降低。为了评价胰岛素敏感性,在胰岛素治疗后检测大鼠腹腔注射葡萄糖耐量试验,计算葡萄糖-胰岛素指数,结果显示早期治疗组大鼠葡萄糖-胰岛素指数明显降低,这些结果说明了胰岛素治疗改善了糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。晚期胰岛素治疗组对空腹血糖和糖化血红蛋白,甘油三酯以及葡萄糖-胰岛素指数也有一定的治疗效果,但疗效不如早期胰岛素治疗组。　　 2.3胰岛素改善肝脏胰岛素作用　　 肝脏组织的丝氨酸/苏氨酸磷酸化胰岛素底物受体1被用来评价肝脏的胰岛素敏感性。免疫沉淀和免疫印迹方法检测肝脏细胞的总蛋白IRS1丝氨酸307位点的磷酸化水平在糖尿病大鼠中明显升高,但胰岛素治疗后,丝氨酸磷酸化IRS1水平明显降低,这说明了胰岛素信号通路的改善。　　 为了评价胰岛素的活性,检测肝脏PEPCK和G6P蛋白表达水平。结果显示PEPCK和G6P蛋白表达水平在糖尿病组大鼠中升高,胰岛素治疗后降低。在早期胰岛素治疗组和晚期胰岛素治疗组丝氨酸磷酸化IRS1、PEPCK和G6P蛋白表达水平之间的差异没有达到统计学意义,但早期和晚期治疗组均降低丝氨酸磷酸化IRS1、PEPCK和G6P蛋白表达水平,这表明了胰岛素治疗改善了肝脏胰岛素的反应性。　　 2.4胰岛素治疗对肝脏JNK活性的影响　　 为了进一步阐明IRS1的丝氨酸磷酸化,肝脏的JNK活性被检测。JNK活性使用JNK1蛋白水平的变化及其激酶活性来评价。磷酸化c-Jun水平在糖尿病大鼠组中明显升高,经过胰岛素治疗后显著降低,而且早期胰岛素治疗组与晚期胰岛素治疗组比较,磷酸化c-Jun水平下降的更明显。JNK的三种亚单位之一的JNK1蛋白水平在糖尿病大鼠肝脏升高,而胰岛素治疗后JNK1蛋白水平下降。这说明糖尿病大鼠肝脏的JNK活性升高,但是胰岛素治疗后其活性显著降低。　　 2.5胰岛素治疗对IRE1α/XBP—1通路的影响　　 IRS1的丝氨酸磷酸化由JNK介导,而JNK由IRE1α激活。为了理解JNK的激活,肝脏组织IRE1α/XBP-1通路的变化被检测。结果发现,糖尿病组IRE1α的蛋白表达水平明显升高,而在胰岛素治疗组中IRE1α蛋白表达水平降低。IRE1α的底物XBP-1也被检测。糖尿病组剪切和未剪切的XBP-1蛋白表达水平明显升高,而在胰岛素治疗组中剪切和未剪切的XBP-1蛋白表达水平降低。另外,在早期胰岛素治疗和晚期胰岛素治疗组IRE1α和剪切和未剪切的XBP-1蛋白表达水平并没有明显不同。这说明了糖尿病组中IRE1α/XBP-1通路活性明显升高,而胰岛素治疗后这一通路的活性下调。　　 2.6胰岛素对内质网应激的影响　　 生理浓度的胰岛素能诱导培养的鼠腹膜巨噬细胞内质网应激,而内质网应激与胰岛素抵抗相关。为了评价胰岛素治疗对动物模型内质网稳态的影响,内质网应激的标志物免疫球蛋白结合蛋白(BIP)的蛋白表达水平被检测。肝脏的BIP蛋白表达水平在糖尿病大鼠中明显升高,但胰岛素治疗后BIP蛋白表达水平明显下降,而且与晚期胰岛素治疗组比较,早期胰岛素治疗组BIP蛋白表达水平下降得更明显。这说明了胰岛素治疗并没有增加内质网应激而是减轻了糖尿病大鼠肝脏的内质网应激。　　 2.7胰岛素对2型糖尿病大鼠肝脏脂肪沉积的治疗效果　　 为了评价胰岛素对2型糖尿病大鼠肝脏脂肪沉积的治疗效果,检测肝脏标本的甘油三酯,结果发现与对照比较,糖尿病组大鼠肝脏的甘油三酯含量增加,经过胰岛素治疗后,早期胰岛素治疗组和晚期胰岛素治疗组大鼠肝脏的甘油三酯含量下降,说明了胰岛素治疗减轻了2型糖尿病大鼠模型肝脏的脂质沉积。　　 2.8胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠肝脏SREBP1蛋白表达的影响　　 为了研究胰岛素治疗减轻了2型糖尿病大鼠模型肝脏的脂质沉积的机制,本研究检测了肝脏脂肪代谢调控的一个重要转录因子SREBP1蛋白表达的变化。糖尿病组大鼠与正常对照组比较SREBP1蛋白水平表达明显增加,经过胰岛素治疗后SREBP1蛋白水平表达下降。并且与晚期胰岛素治疗组比较,早期胰岛素治疗组SREBP1蛋白水平表达的下降的程度更明显。这提示糖尿病组大鼠肝脏内质网固醇调节级联反应被激活,经过胰岛素治疗组该反应下调。　　 2.9胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠肝脏PPARa蛋白表达的影响　　 PPARa是肝脏脂肪代谢调控的另一个重要因素,并且也对SREBP1的表达有负调控作用。糖尿病组大鼠与正常对照组比较PPARa蛋白水平表达增加,经过胰岛素治疗后PPARa蛋白水平表达进一步增加。这些结果提示糖尿病组和胰岛素治疗组大鼠PPARa被激活。　　 2.10胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠肝脏缺氧反应的影响　　 缺氧与脂肪肝关系密切,缺氧诱导因子1a调控SREBP1的表达,本研究检测了介导缺氧反应的分子mRNA或蛋白表达水平的变化。糖尿病组大鼠与正常对照组比较HIF—1a mRNA和及其下游信号分子Glut1mRNA表达增加,经过胰岛素治疗后下降,说明了胰岛素治疗是糖尿病大鼠肝脏的缺氧得到了部分缓解。　　 内质网分子伴侣ORP150能被缺氧特异性诱导,本研究检测了ORP150蛋白水平的变化,糖尿病组大鼠与正常对照组比较ORP150蛋白表达增加,经过胰岛素治疗后ORP150表达下降,说明了胰岛素治疗改善了糖尿病大鼠肝脏缺氧状态。　　 结论:　　 1、胰岛素治疗没有加重而是减轻了2型糖尿病大鼠肝脏内质网应激(创新点1)。　　 2、胰岛素通过减轻内质网应激和JNK活性来改善2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素敏感性(创新点2)。　　 3、胰岛素治疗能改善糖脂代谢异常和缺氧状态及激活PPARa。通过这些有利效应下调内质网固醇调节级联反应改善糖尿病大鼠肝脏的脂肪沉积(创新点3).