纳豆是日本传统的发酵食品,在日本已经食用有两千年的历史。1987年日本的须见洋行等人首次从纳豆中分离出了具有纤溶活性的蛋白激酶,并将之命名为纳豆激酶（nattokinase,NK）。该酶为碱性丝氨酸蛋白酶,由枯草牙孢杆菌发酵产生,具有很强的溶血栓能力。目前心血管疾病已成为了人类健康的最大威胁之一,溶栓酶是治疗心血管疾病的有效方法。纳豆激酶是目前一种不错的溶栓物质,因其与传统的溶栓剂相比该酶具有安全性好、半衰期长、口服有效等优点而受到了广泛的关注。国内外血多学者对纳豆激酶进行了发酵、分离纯化、克隆表达等研究。它的等电点为8.6±0.3,成熟肽由275个氨基酸组成,相对分子质量27 KDa。由于纳豆激酶的溶栓功能,目前主要将其发展为溶栓类药物和溶栓类保健品。它的获得主要有两种途径:一是发酵分离,通过改良菌种和优化纳豆生产工艺等方法来提高纳豆中纳豆激酶活性;另外通过基因工程方法,将纳豆激酶基因导入到特定的表达宿主中来提高纳豆激酶产量。本研究从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取纳豆激酶总基因组DNA,通过Primer 5设计引物,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。经克隆到PMDT-19载体上进行验证,然后送出上海生工测序,所得基因序列结果与NCBI上所发表的序列完全一致。将扩增获得的目的片段和表达载体pPICZaA同时进行双酶切,然后通过T4 DNA连接酶构建重组表达质粒pPICZaA/NK,经PCR验证、EcoRI、XbaI双酶切和测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为长825bp的目的片段。按照毕赤酵母表达手册的操作制备感受态毕赤酵母X33,将重组质粒pPICZaA/NK用限制性内切酶SacI线性化后电击转化方式导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,每隔24h添加1%的甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析带透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27 KDa。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/ml。将分离得到的纳豆激酶样品,分别放在PH为4-11的环境中,然后测活性得出在PH为8左右的时候活性最大。另外实验表明在40℃左右纳豆激酶活性最大,低温对其活性不影响,而当温度超过45℃后纳豆激酶的活性迅速降低。本实验成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶的研究进行了一些探索,为进一步工程研究奠定基础。